1-6-1: مننژیت… 15

 

1-7:درمان: 15

 

1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها 15

 

1-8: تشخیص: 18

 

1-8-1: روش کشت… 18

 

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

 

1-8-3: روش مولکولی.. 19

 

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

 

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

 

1-9-1-1: منطقه I. 22

 

1-9-1-3: منطقه II. 22

 

1-9-1-2: منطقه III. 22

 

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

 

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

 

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

 

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

 

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

 

1-11: Real-time PCR.. 28

 

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

 

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

 

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

 

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

 

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

 

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

 

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

 

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

 

1-12: بیان مساله. 34

 

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

 

1-14: اهداف پژوهش…. 36

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

 

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1: محیط های کشت… 43

 

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

 

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

 

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

 

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

 

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

 

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

 

3-2: کشت نمونه ها 45

 

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

 

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

 

3-3-2: روش فریز کردن. 45

 

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

 

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

 

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

 

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

 

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

 

 

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

 

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

 

3-5-2: پرایمرها 48

 

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

 

3-5-3: برنامه PCR.. 49

 

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

 

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

 

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

 

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

 

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

 

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

 

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

 

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

 

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

 

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

 

3-6: استخراج PRP. 54

 

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

 

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

 

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

 

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

 

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

 

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

 

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

 

3-8:تعیین تعداد کپی cap با استفاده از Real-time PCR: 57

 

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

 

3-8-2: شرایط واکنش: 57

 

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

 

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

 

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

 

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

 

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR : 62

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

 

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

 

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

 

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

 

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

 

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

 

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

 

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

 

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

 

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

 

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

 

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

 

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

 

5-3: پیشنهادات… 87

 

منابع  …   89

 

خلاصه انگلیسی.. 98

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7

 

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

 

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

 

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

 

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

 

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

 

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

 

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

 

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

 

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

 

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

 

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

 

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

 

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

 

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

 

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

 

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

 

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

 

فهرست تصاویر

 

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

 

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

 

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

 

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

 

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

 

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

 

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

 

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

 

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

 

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

 

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

 

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

 

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

 

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

 

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65