1-2-3-3     روش­های انجماد. 19

 

1-2-3-3-1     انجماد آهسته. 20

 

1-2-3-3-2     انجماد شیشه­ای.. 21

 

1-2-4     سوراخ کردن مصنوعی.. 22

 

2     مواد و روش­ها…………………..25

 

2-1     حیوان.25

 

2-2     تولید رویان آزمایشگاهی26

 

2-2-1     استحصال اسپرم. 26

 

2-2-1-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 26

 

2-2-1-2     جابجایی مهره­ی گردنی.. 27

 

2-2-1-3     تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم. 28

 

2-2-1-4     جمع­آوری و ظرفیت­پذیری اسپرم. 29

 

2-2-2     استحصال تخمک… 31

 

2-2-2-1     تحریک تخمک­گذاری.. 31

 

2-2-2-1-1      تزریق داخل صفاقی.. 31

 

2-2-2-2     آماده­سازی محیط و قطره­ها 32

 

2-2-2-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 32

 

2-2-2-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­ی تخم­بر. 32

 

2-2-2-5     جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس… 33

 

2-2-3     لقاح آزمایشگاهی.. 34

 

2-2-3-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 34

 

2-2-3-2     لقاح.. 35

 

2-2-4     کشت آزمایشگاهی.. 35

 

2-2-4-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 35

 

2-2-4-2     کشت رویان. 36

 

2-3     تولید رویان درون­تنی37

 

2-3-1     تحریک تخمک­گذاری و جفت اندازی موش­ها 37

 

2-3-2     آماده­سازی محیط و قطره­ها 37

 

2-3-3     جابجایی مهره­ی گردنی.. 37

 

2-3-4     تشریح موش ماده و جداسازی لوله­های رحمی.. 37

 

2-3-5     استحصال بلاستوسیست… 38

 

2-4     سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست39

 

2-4-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 39

 

2-4-2     آماده­سازی و تنظیم دستگاه ریز­دستکاری.. 40

 

2-4-3     روش کار. 40

 

2-5     انجماد رویان41

 

2-5-1     انجماد شیشه­ای.. 41

 

2-5-1-1     آماده­سازی محیط و قطره­ها 41

 

2-5-1-2   روش کار. 42

 

2-5-2        یخ­گشایی.. 43

 

2-5-2-1     آماده­سازی محیط و قطرات… 43

 

2-5-2-2   روش کار. 44

 

2-6     بررسی بیان ژن.45

 

2-6-1     استخراج RNA از بلاستوسیست… 45

 

2-6-2     ساخت cDNA.. 46

 

2-6-3      طراحی پرایمر. 47

 

2-6-4     رقیق­سازی پرایمرها 47

 

2-6-5     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 48

 

2-6-6     ژل الکتروفورز محصولات PCR.. 49

 

2-6-7     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 49

 

2-7     طراحی آزمایش52

 

2-7-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای52

 

2-7-2     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش، قبل از انجماد شیشه­ای..52

 

 

2-7-3     آنالیز آماری.. 52

 

3     نتایج.54

 

3-1     کاهش مایع بلاستوسل رویان­های درون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه­ای……………54

 

3-1-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 54

 

. 56

 

3-1-2-1     واکنش زنجیرهای پلیمراز. 56

 

3-1-2-2     واکنش زنجیرهای پلیمراز در زمان واقعی.. 57

 

3-2      کاهش مایع بلاستوسل رویان­های برون­تنی موش قبل از انجماد  شیشه­ای.62

 

3-2-1     نرخ زنده­مانی و خروج از زونا 62

 

. 64

 

4     بحث و نتیجه­گیری67

 

5     فهرست منابع..76

 

6     پیوست­ها83

 

فهرست جداول

 

جدول ‏1‑1: ترکیبات محیط HTF. 14

 

جدول ‏1‑2: ترکیبات محیط KSOM.. 16

 

جدول ‏2‑1: محلول­های مورد نیاز برای انجماد شیشه­ای بلاستوسیست موش.. 42

 

جدول ‏2‑2: محلول­های مورد نیاز برای یخ­گشایی بلاستوسیست موش.. 44

 

جدول ‏2‑3: مواد مورد استفاده جهت ساخت cDNA. 46

 

جدول ‏2‑4: چرخه­های حرارتی ساخت cDNA. 46

 

جدول ‏2‑5: مشخصات پرایمرهای طراحی شده 47

 

جدول ‏2‑6: مواد مورد نیاز جهت انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز 48

 

جدول ‏2‑7: چرخه­های حرارتی مراحلPCR 48

 

جدول ‏2‑8: مواد مورد نیاز جهت انجام Real Time PCR. 50

 

جدول ‏2‑9: چرخه­های حرارتی Real Time PCR. 50

 

جدول ‏3‑1: میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست درون­تنی موش.. 55

 

جدول ‏3‑2:  میزان زنده­مانی و میزان خروج از زونای بلاستوسیست برون­تنی موش. 63

 

فهرست اشکال

 

شکل ‏1‑1: مراحل مختلف تکوین پیش از لانه­گزینی در موش.. 2

 

شکل ‏1‑2: بخش­های مختلف لوله­ی تخم­بر. 3

 

شکل ‏1‑3: فرایند گامت­زایی. 4

 

شکل ‏1‑4: اسپرم و تخمک پستانداران. 5

 

شکل ‏1‑5: قطبیت رویان موش. 6

 

شکل ‏1‑6: تقسیم مرحله­ی 8 به 16 سلولی. 7

 

شکل ‏1‑7: تشکیل حفره­ی بلاستوسل. 7

 

شکل ‏1‑8: آرایش سیستم­های انتقالی در سلول­های تروفواکتودرم 8

 

شکل ‏1‑9: بلاستوسیست در حال خروج از زونا 9

 

شکل ‏1‑10: مسیر تمایز رده تروفواکتودرم در موش. 10

 

شکل ‏1‑11: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپی­بلاست در سه مرحله 11

 

شکل ‏1‑12: دخالت مسیر پیام­رسان FGF/MAPK 13

 

شکل ‏1‑13: فرایند شیشه­ای شدن محیط انجماد. 21

 

شکل ‏1‑14: روش­های مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفره­ی بلاستوسل. 24

 

شکل ‏2‑1: قفس­های دارای سیستم تهویه­ی مجزا 26

 

شکل ‏2‑2: پتری دیش استحصال اسپرم 27

 

شکل ‏2‑3: جابجایی مهره­های گردنی. 28

 

شکل ‏2‑4: تشریح موش نر 29

 

شکل ‏2‑5: جمع­آوری اسپرم 30

 

شکل ‏2‑6: نحوه­ی جمع­آوری اسپرم­های زنده از حاشیه­ی قطره­ی محیط کشت.. 30

 

شکل ‏2‑7: نحوه­ی ترزیق داخل صفاقی موش.. 31

 

شکل ‏2‑8: پتری دیش استحصال تخمک.. 32

 

شکل ‏2‑9: جداسازی لوله­ی تخم­بر. 33

 

شکل ‏2‑10: جداسازی توده­ی تخمک-کومولوس.. 34

 

شکل ‏2‑11: پتری دیش IVF. 34

 

شکل ‏2‑12: تخمک-کومولوس­های مجزا 35

 

شکل ‏2‑13: نحوه­ی قطره­گذاری محیط KSOM در پلیت کشت رویان. 36

 

شکل ‏2‑14: جداسازی لوله­های رحمی. 38

 

شکل ‏2‑15: استحصال بلاستوسیست از لوله­ی رحمی. 39

 

شکل ‏2‑16: پتری دیش ریز دستکاری. 40