1-5-6 بیمارى شبه بروسلوز………………………………………………………………….

 

        1-5-7 بروسلوز ناشى از تلقیح واكسن حیوانى………………………………………..

 

1-6 انتقال بیماری………………………………………………………………………………………….

 

1-7 پاسخ های ایمنی میزبان به بروسلا…………………………………………………………….

 

1-8 روشهای تشخیص…………………………………………………………………………………..

 

1-9 درمان بیماری ………………………………………………………………………………………..

 

1-10 واکسیناسیون…………………………………………………………………………………………

 

1-10-1 تولید پروتئین نوترکیب  Omp31…………………………………………….

 

1-10-2 استفاده از NPAP…………………………………………………………………..

 

1-10-3 استفاده از بروسلا ملیتنسیس سویه WR201……………………………………..

 

1-10-4 استفاده ازپروتئینهای غشاءداخلی16و19(Omp16&Omp19)بروسلاآبورتوس

 

1-10-5 تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهایmanBA ،virB2 و asp24  در هر دو سویه بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس  

 

1-10-6 جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS………………………………………….

 

1-10-7 استفاده از LPS خالص شده بروسلا ملیتنسیس……………………………………

 

1-10-8 استفاده از پروتئین CP24…………………………………………………………………

 

1-10-9 نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانی بروسلا ملیتنسیس…

 

1-10-10 مجوز استفاده از واکسن بروسلا   ابورتوس سویه RB51 برای استفاده در گاوها…

 

1-11 دیواره سلولی باکتری های گرم منفی……………………………………………………….

 

        1-11-1 اندوتوکسین …………………………………………………………………………..

 

        1-11-2 ساختمان LPS ………………………………………………………………………

 

        1-11-3  عملکرد LPS………………………………………………………………………..

 

        1-11-4 تاثیرات LPS………………………………………………………………………….

 

1-12نایسریا………………………………………………………………………………………………….

 

       1-12-1 پورین های مننگوکوک………………………………………………………….

 

       1-12-2  PorA…………………………………………………………………………………..

 

فصل دوم: (سابقه وپیشینه تحقیق)

 

فصل سوم: (مواد و روشها)

 

3-1 وسایل مورد استفاده ……………………………………………………………………………….

 

3-2 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………

 

3-3 روش کار ……………………………………………………………………………………………..

 

3-4 رنگ آمیزی گرم …………………………………………………………………………………….

 

3-5 طرز تهیه استوک ………………………………………………………………………………

 

3-6 روش استخراج DNA پلاسمیدی …………………………………………………………..

 

      3-6-1 طرز تهیه محلولهای مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………….

 

      3-6-2 مراحل استخراج DNA پلاسمیدی……………………………………………….

 

3-7 الکتروفورز …………………………………………………………………………………………..

 

      3-7-1 طرز تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………

 

      3-7-2طرز تهیه بافرTBE(1X)…………………………………………………………….

 

3-8  بررسی بیان پروتئین……………………………………………………………………………..

 

3-9  نحوه آماده سازی جایگاه ژل…………………………………………………………………

 

3-10 روش تهیه بافر متراکم کننده…………………………………………………………….

 

3-11 روش تهیه بافر جداکننده ……………………………………………………………….

 

3-12 روش تهیه بافر تانک……………………………………………………………………..

 

3-13 آماده سازی الکتروفورز عمودی……………………………………………………………

 

       3-13-1 آماده سازی پروتئین ………………………………………………………………

 

       3-13-2 بارگذاری پروتئین………………………………………………………………….

 

3-14 رنگ آمیزی ژل.SDS-PAGE…………………………………………………………..

 

        3-14-1 ساخت محلول رنگ………………………………………………………………

 

        3-14-2 نحوه رنگ آمیزی…………………………………………………………………..

 

3-15 خالص سازی پروتئین نوترکیب E.coli………………………………………………..

 

3-16 شکستن سلولها برای آزادسازی پروتئین………………………………………………..

 

3-17 خالص سازی با ستون نیکل سفارز……………………………………………………….

 

        3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی………………………..

 

 

3-18 بردفورد……………………………………………………………………………………………

 

        3-18-1 تهیه معرف بردفورد…………………………………………………………..

 

3-19 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………………….

 

          3-19-1 پروتکل جدا سازی LPS……………………………………………………

 

          3-19-2 تهیه محلول دیالیز یا بافرفسفات…………………………………………..

 

3-20 سنجش غلضت  LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………..

 

         3-20-1 تهیه LPS منحنی استاندارد………………………………………………….

 

3-21 روش کونژوگاسیون LPS با  PorA…………………………………………………..

 

3-22 خالص سازی کونژوگاسیون………………………………………………………………..

 

 

 

فصل چهارم:(نتایج )

 

4-1 احیا باکتری نوترکیب PorA……………………………………………………………….

 

4-2 استخراج DNA پلاسمیدی ……………………………………………………………….

 

4-3 بررسی بیان پروتئین …………………………………………………………………………..

 

4-4 خالص سازی پروتئین نوترکیب PorA………………………………………………..

 

4-5 بردفورد…………………………………………………………………………………………….

 

4-6 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………………

 

4-7 سنجش غلظت LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………

 

4-8 کونژوگاسیون LPS باPorA………………………………………………………………

 

فصل پنجم: (بحث)…………………………………………………………………………………..

 

نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….

 

منابع و ماخذ …………………………………………………………………………………………..

 

 فهرست جدول ها

 

جدول1-1 طبقه بندی بروسلا……………………………………………………………………………………………

 

جدول 1-2 مقایسه بیماری زایی گونه های مهم بروسلا……………………………………………………….

 

جدول1-3 فراوانی شکایات بیماران مبتلا به بروسلوز بستری…………………………………………………

 

جدول1-4 فراوانی بعضی از یافته های بروسلوز طی چند فقره مطالعه…………………………………….

 

جدول 3-1 بافر جدا کننده 12%…………………………………………………………………………………………

 

جدول3-2 بافر متراکم کننده 6%…………………………………………………………………………………………

 

جدول3-3 بافر تانک………………………………………………………………………………………………………..

 

جدول3-4 تهیه معرف بردفورد………………………………………………………………………………………….

 

جدول3-5 تهیه معرف مورد استفاده در سنجشLPS…………………………………………………………..

 

 

 

فهرست شکل ها

 

شکل1-1 انواع سلولهایی که توسط باکتری بروسلا آبورتوس در میزبان طبیعی و در میزبان تصادفی درگیر میشوند…………………………………………………………………………………………………………………….

 

شکل1-2 شکل فرضی از تعاملات باکتری بروسلا آبورتوس با ماکروفاژ……………………………………

 

شکل 3-1 الکتروفورز با ژل پلی اکریل آمید…………………………………………………………………………..

 

شکل 4-1 کشت پارویی……………………………………………………………………………………………………..

 

شکل 4-2 DNA  پلاسمیدی……………………………………………………………………………………………..

 

شکل4-3SDS-PAGE,PorA ………………………………………………………………………………………..

 

شکل 4-4 باند خالص سازی شده PorA……………………………………………………………………………..

 

شکل 4-5 معادله منحنی استاندارد برای سنجش غلضت پروتئین خالص سازی شده PorA………..

 

شکل4-6 باندهای LPSبروسلا ملیتنسیس…………………………………………………………………………….

 

شکل 4-7 معادله منحنی استاندارد سنجشLPS…………………………………………………………………..

 

چکیده

 

بروسلوز یکی از پنج بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتری های جنس بروسلا به وجود می آید . بروسلاها ، باکتری های کوچک ، غیر متحرک ، گرم منفی کوکوباسیل و درون سلولی اختیاری که در طیف وسیعی از حیوانات ایجاد بیماری می کنند . بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس عمده ترین گونه های عامل بروسلوز انسانی هستند. واکسنهای بروسلوز حیوانی شامل باکتریهای غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته دو مشکل اساسی در انسان ایجاد می کنند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری مینمایند و دوم آنکه با واکنشهای ازدیاد حساسیت ناخواسته همراه اند. در همین راستا در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژنهای مختلفی از گونه های بروسلا به شکل مونووالان طبیعی کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم ،لیپوپولی ساکارید(LPS) بعنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی، فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.همچنین LPS به لحاظ ایمونولوژیک آنتی ژن اصلی سطح سلولی بروسلا محسوب میشود. به همین دلیل امروزه استفاده از LPS بروسلا به دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار میگیرد.امروزه پژوهش های متعددی در زمینه واکسن های زیر واحدی مونووالانت و یا کونژوگه ،با جایگزینی اجزاء دیگر باکتری از جمله پروتئین های غشاء خارجی جهت ایجاد پاسخ های ایمنی وابسته به لنفوسیتTصورت گرفته است  وزیکول غشاء خارجی مننگوکوک(OMV) متشکل از پروتئینهای کلاس 1 تا 4،فسفولیپید پلی ساکارید کپسولی و لیپواولیگوساکارید میباشد،این ماکرومولکول در خلال سیر رشد باکتری در بدن میزبان رها میشود و پژوهش ها نشان میدهد که نقش عمده ای را در القائ ایمنی حفاظت بخش پس از ابتلا به بیماری دارد.از مهمترین اجزائ این ماکرومولکول میتوان به PorA،از خانواده کلاس1 پروتئین غشائ خارجی اشاره نمود که توانایی ایجاد پاسخ های باکتریسیدی را دارد.  علاوه بر این وجود سایر ترکیبات از جمله لیپوالیگوساکارید و فسفولیپیدها،دارای خاصیت آدجوانتی بوده و پاسخ حفاظتی مناسبی را در انسان ایجاد مینمایند.

 

در این مطالعه ویال لیوفلیزه، حاوی porA ای که داخل E.coli کلون شده بود احیا گردید سپس برای اطمینان از اینکه porA روی پلاسمید باکتری کلون شده است استخراج DNA پلاسمیدی   انجام شد.در مرحله ی بعد بیان پروتئین porA انجام گردید و برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین ، با روش SDS-PAGE بررسی شد. برای بیشترین بیان ،خالص سازی پروتئین با ستون کروماتوگرافی (نیکل – سفاروز) انجام گردید وسپس با انجام بردفورد غلظت پروتئین  بدست آمد.در مرحله ی بعد LPS بروسلا ملیتنسیس جداسازی گردید و برای بررسی کیفیت و کمیت آن با روش SDS-PAGE بررسی شد وسپس با انجام ازمایش غلظت LPS بدست آورده شد.در نهایت LPS بروسلا ملیتنسیس  با porA نیسریا کونژوگه گردید.

 

بیشترین بیان پروتئین porA  در ساعت چهارم و پنجم در محدوده ی باند 65KD مشاهده شد . پس از خالص سازی پروتئین یک باند تک در محدوده ی 65KD مشاهده گردید و با انجام بردفورد غلظت پروتئین porA ،5 میکروگرم بر میلی لیتر بدست آمد.رویSDS-PAGE باندهای LPS  مشاهده شد .با انجام ازمایش غلظت LPS ،  97/3میکروگرم برمیلی لیتر بدست آمد.

 

کلمات کلیدی:لیپوپلی ساکارید ، بروسلا ملیتنسیس، نیسریا مننژیتیدیس، وزیکول غشای خارجی (OMV) ،porA

 

فصل اول

 

مقدمه

 

 1-1-طبقه بندی بروسلا:

 

بروسلاها جزء آلفا پرتئوباکتریا هستند و از نظر فیلوژنیک با باکتریهای پاتوژن و همزیست  (از جمله ریزوبیوم و آگرباگتریوم) گیاهان ، پارازیت های داخل سلولی جانوران ( از جمله بارتونلا و ریکتزیا) و فرصت طلب ها و آزادزیها مانند اوکراباکتریوم و کلوباکتر مرتبط می باشند .(کلاسن وهمکاران،1996؛ مورنو و همکاران ،2002 ؛ پریسنت و همکاران،2002 )

 

جنس بروسلا بر اساس تفاوت آنتی ژنتیک ، میزبان اصلی ، کشت باکتری در محیط ها و شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف ، واکنش با آنتی سرمهای اختصاصی و تشابه DNA به هفت گونه تقسیم می گردد ، خصوصیات کلی این گونه ها در جدول( 1-1) آمده است . تاکنون 7 بیووار در بروسلا آبورتوس ، 3 بیووار در بروسلا ملی تنسیس و 5 بیوار در بروسلا سویس را مشخص نموده اند . در سایر گونه ها تاکنون بیووار خاصی شناخته نشده است (مورنو و همکاران،2002 ؛یانگ،1995؛جاوتز و همکاران،1998؛کو و همکاران،2003)  

 

جدول 1-1: طبقه بندی بروسلا