1-6-4 حمله به CNS…………………………………………………………………………………….26

 

1-1-5 شاخص‌های بیماری زایی هموفیلوس آنفولانزا…………………………………………………………………………………27

 

1-2-5 OMPs………………………………………………………………………………………………………………………..28

 

1-3-5-  پیلی……………………………………………………………………………………………………………………28

 

1-4-5-  ایمونوگلوبولین A₁ پروتئاز……………………………………………………………………………….30

 

1-5-5- لیپوپلی ساکارید (LPS) …………………………………………………………………………………………………………………………………..31

 

1-6-5-  نقش LPS در بیماری‌زایی……………………………………………………………………………………………………………………………..32

 

1-1-6 کپسول…………………………………………………………………………………………………………………34

 

1-2-6-  دخالت کپسول در بیماری‌زایی………………………………………………………36

 

1-3-6-  ژنتیک بیان کپسول………………………………………………………….36

 

1-1-8 روش­ها و آزمون­های تشخیص آزمایشگاهی………………………………………………………38

 

1-2-8 روش­های تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………….38

 

1-3-8- معایب تشخیص کلاسیک……………………………………………………………………………………39

 

1-4-8- برتری روش­های تشخیص مولکولی………………………………………………………………………………..40

 

1-1-9- اپیدمیولوژی …………………………………………………………………………..40

 

1-1-10- پیشگیری …………………………………………………………………………………………….44

 

1-1-11- درمان……………………………………………………………………………………………………………45

 

2-1 واکسن های کونژوگه…………………………………………………………………….48

 

2-2- واکسن‌های Hib………………………………………………………………………………………..49

 

2-3- پاسخ های واکسن کونژوگه…………………………………………..50

 

2-4-  پاسخ های واکسن پلی‌ساکاریدی…………………….51

 

2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی………………………………………………………………..51

 

2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی ………………………………..51

 

2-5-2- نوع اتصال…………………………………………………………………………………………………52

 

2-5-3-  مولکول های حامل  ……………………………………………………52

 

2-6-EDC یا EDAC…………………………………………………………………………………………52

 

2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون  ………………………………………………………53

 

2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن¹ – حامل……………………………………………………….54

 

2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک…………………………………………………..55

 

2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه………………………………………………………………………………….56

 

2-11- سنجش فعالیت باكتری كشی……………………………………………………………………56

 

فصل سوم- مواد و روش ها

 

3-1-1 مواد و وسایل لازم ……………………………………………………………………60

 

3-2-1- تهیه میكروارگانیسم های به كار گرفته شده در این مطالعه……………………………………………………………………………………………………66

 

3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن……………………………………………………………66

 

3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP………………………………………………………………………………………………………..66

 

3-2-4- تهیه بذر محیط کشت …………………………………………………..66

 

3-2-5-تیمار عصاره مخمر…………………………………………………………………..67

 

3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر ………………………………………………………………………………………………..70

 

3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور…………………………………………………..72

 

3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی………………………………………..73

 

3-2-9- مرحله الکل زنی ……………………………………………………………………….73

 

3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم………………………………………………………………………………………….74

 

3-2-11- تیمار با ستاولن…………………………………………………………………………74

 

3-2-12- افزودن فسفات سدیم………………………………………………….75

 

3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد…………………………………………..75

 

3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت………………………………75

 

3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت …………………………………………76

 

3-2-16- لیوفلیزاسیون ……………………………………………………………………………….76

 

3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده  ………………………………………………………………………………………………………….76

 

3-2-18- تست ریبوز  …………………………………………………………………………………76

 

3-2-18- 1- اساس تست بیال  …………………………………………..77

 

 

3-2-18- 2- معرف‌های تست بیال  ……………………………….77

 

3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات  ………………………………………….77

 

3-2-18- 4-تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز  ………………………………………………………………………..77

 

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده  ……………………………………………………………………………….79

 

3-3-1- آزمون های پروتئین سنجی ……………………………………………………………………………………………….79

 

3-3-2روش برادفورد …………………………………………………………………………………..81

 

3-3-3- روش پروتئین سنجی  Lowry ………………………………………………………………81

 

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن  ………………………………………………………………….83

 

3-5- سنجش نوکلئیک اسید …………………………………………………………………………………………………….83

 

3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژینوزا PA103   …………………………………………………………………….84

 

3-6-1- طرز باز كردن سوش لیوفیلیزه جدید …………………………………………………………………………..84

 

3-6-2-تهیه لوله بذر ……………………………………………………………………………………….84

 

3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش …………………………………………………………………………..85

 

3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A ………………………………………………………………………………………………..85

 

3-6-5-تهیه محیط کشت ………………………………………………………………………85

 

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار ………………………………………………………….87

 

3-6-8- رسوب با سولفات آمونیوم …………………………………………………………………………………………..87

 

3-6-9- دیالیز اگزوتوكسین   A …………………………………………………………………………….88

 

3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسین  A   ………………………………………………………………………………..89

 

3-16-2-1مواد مورد نیاز: ………………………………………………………………………89

 

3-6-11سنجش تولید اگزوتوكسین  ………………………………………………………..89

 

3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی  ……………………………………………………………………………….90

 

3-6-12- دتوكسیفای كردن اگزوتوكسین A  به روش فرمآلدیئد  ……………………………………………………………………………91

 

3-7- ژل فیلتراسیون جهت تخلیص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb  (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا …………………..92

 

3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….92

 

3-9- سنجش پروتئین  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………92

 

3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..93

 

3-12- كنترل توكسیسیته غیرعادی((Abnormal toxicity ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

 

3-13- آزمون پیروژنی  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

 

3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………94

 

3-15تهیه بافر باربیتال : ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..94

 

3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر : ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….94

 

3-16- پلی آكریل آمید ژل الكتروفورز درحضور سدیم دو دسیل سولفات(SDS-PAGE)  ………………………………………………………..96

 

3-16-1- اصول روش SDS-PAGE  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….96

 

3-16-3- محلول­های مورد نیاز ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

 

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….97

 

3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………98

 

3-16-6-رنگ آمیزی ژل پلی آكریل آمید  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………99

 

3-16-7- محلول­های مورد نیاز  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………100

 

3-16-8- روش رنگ آمیزی  …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………101

 

3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA) ………………………………………………………………………………………………………………………………….101

 

3-17-1- اصول آزمون SBA  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….101

 

3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) …………………………..101

 

3-17-3-روش انجام آزمون  ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………102

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1-کشت سویه باکتری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

 

4-2- شرایط کشت در فرمانتور……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

 

4-3- تعیین خلوص PRP  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..109

 

4-4- اندازه‌گیری میزان ریبوز ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….111

 

4-5- کنترل میزان پروتئین در پلی ساکارید PRP و  ETA و  PRP- ETA……………………………………………………………………………………………………………..113

 

4-6-  کنترل میزان اسید نوکلئیک در پلی ساکارید PRP و   PRP- ETA………………………………………………………………………………………………………………………..113

 

4-7- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسینA سودوموناس آئروژینوزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………114

 

4-8- بازده کونژوگاسیون PRP-ETA  ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115

 

4-9- کنترل پیروژنی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..115

 

4-10- کنترل توکسیسیتی غیر عادی در موش سوری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

 

4-11- آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………116

 

4-12- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای بررسی وزن مولکولی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

 

4-13- ارزیابی فعالیت باکتری كشی سرم حیوان واکسینه شده ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….117

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1- واکسن‌های کونژوگه‌ی (Hboc) PRP-CRM197………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….124

 

5-2- واکسن کونژوگه‌ی PRP-TT ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

 

5-3-  واکسن کونژوگه‌ی PRP-OMP ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..125

 

5-4- تولید کپسول هموفیلوس آنفولانزای تیپ b(PRP) …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

 

5-5- کونژوگاسیون PRP با اگزوتوکسین A…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….127

 

5-6- سرم باکتریسیدال اسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….128

 

نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ……………………………………………………………….129

 

پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ………… …………………………………………………………129

 

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130

 

فهرست شکل ها

 

شکل 1-1 کلونی هموفیلوس آنفلوانزا در محیط شکلات آگار……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..19

 

شکل1-2 هموفیلوس آنفلوانزا………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….20

 

شکل1-3 تیپ های مختلف کپسول هموفیلوس آنفلوآنزا…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………35

 

شکل 1-4 پراکندگی سنی عفونت Hib از اکتبر 1990 تا سپتامبر 1991 در شش منطقه در انگلستان و والس. از 433 مورد گزارش شده (84%)  362 مورد به علت hib ، (13%) 54 مورد به علت غیر سروتیپی و 13 مورد سروتیپ نشده بودند…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….41

 

شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..67

 

شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………70

 

شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………71

 

شکال3-4 راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد –  چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..72

 

شکال3-5رسوب حاصل از الکل زنی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..74

 

شکل3-6 تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت) …………………………………………………………………………………………………………….78

 

شکل 3-7 رسوب با سولفات آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88

 

شکل 3-8 دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89

 

شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107

 

شکل 4-2  تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107

 

شکل 4-3 طیف سنجی NMR    ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110

 

شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111

 

شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116

 

شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای  PRP-ETA و  ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

 

فهرست جدول ها و نمودارها

 

نمودار 3-1نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83

 

جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108

 

نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

 

نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109

 

نمودار 4-3  تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110

 

جدول 4-2  تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

 

نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112

 

جدول 5-3- میزان ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….112