1-4- شمارش، جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 13

 

 

1-5- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 15

 

 

1-6- پی سی آر (PCR). 15

 

 

1-6-1- تاریخچه. 16

 

 

1-6-2- اساس و روش کار. 18

 

 

1-6-3- مراحل PCR.. 19

 

 

1-6-4- پارامترهای مؤثر در PCR.. 20

 

 

1-7- مدل سازی.. 21

 

 

1-8- فرضیات پژوهش…. 25

 

 

1-9- اهداف پژوهش…. 25

 

 

فصل دوم

 

 

2-1- شناسایی باکتری های اسید استیک با استفاده از روش های مدرن.. 27

 

 

2-2- تولید سرکه زردآلو با استفاده از Acetobacter جدا شده از زردآلوی ایرانی.. 34

 

 

2-3- تولید سرکه آناناس و بررسی تاثیر متقابل بین مخمر و باکتری اسید استیکی.. 34

 

 

2-4- جداسازی و شناسایی نژاد Acetobacter از گیلاس سفید- قرمز ایرانی به عنوان نژادی با قابلیت تولید اسید بالا در تولید سرکه  36

 

 

2-5- بهینه سازی عوامل موثر در فرآیند تولید سرکه با استفاده از تخمیر موز. 36

 

 

2-6- روش های مدل سازی میکروبی.. 37

 

 

فصل سوم

 

 

3-1-زمان و مکان تحقیق.. 42

 

 

3-2- مواد مصرفی.. 42

 

 

3-2-1- خارک خرمای هلیله ای.. 42

 

 

3-2-2- سرکه خرما 42

 

 

3-2-3- مواد شیمیایی.. 43

 

 

3-2-4- مواد ژنتیکی.. 43

 

 

3-3- تجهیزات… 44

 

 

3-4- اندازه گیری ترکیبات خارک خرما 45

 

 

3-4-1- اندازه گیری قند. 45

 

 

3-4-2- اندازه گیری فیبر. 46

 

 

3-4-3- اندازه گیری فسفر. 46

 

 

3-4-4- اندازه گیری کلسیم. 47

 

 

3-4-5- اندازه گیری پتاسیم. 48

 

 

3-4-6- اندازه گیری رطوبت.. 48

 

 

3-4-7- اندازه گیری خاکستر. 49

 

 

3-4-8- اندازه گیری پروتئین.. 49

 

 

3-4- مرحله جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی و شناسایی آن ها 50

 

 

 

3-4-1- روش کشت.. 50

 

 

3-4-2- خالص سازی باکتری های استیکی.. 51

 

 

3-4-2-1- نگهداری جدایه های باکتری های اسید استیک…. 52

 

 

3-5-آزمون های تاییدی باکتری های استیکی.. 52

 

 

3-5-1-آزمون کاتالاز. 52

 

 

3-5-2- آزمون گرم. 53

 

 

3-6- استخراج DNA از جدایه های باکتریایی.. 54

 

 

3-7- انجام PCR و تکثیر ناحیه s rDNA16. 55

 

 

3-7-1- واکنش PCR. 55

 

 

3-7-2- تعیین توالی و مقایسه توالی ها 56

 

 

3-8- مرحله تولید الکل با استفاده از مخمر. 57

 

 

3-8-1-تهیه سوسپانسیون مخمر. 57

 

 

3-9- مرحله تهیه سرکه از محلول الکلی تهیه شده از تخمیر الکلی.. 59

 

 

3-9-1- انتخاب ایزوله های باکتری اسید استیک… 59

 

 

3-9-2- تهیه سوسپانسیون باکتری ها 59

 

 

3-10- آزمون های میکروبی و شیمیایی سرکه. 61

 

 

3-10-1- آزمون میکروبی.. 61

 

 

3-10-2- آزمون اندازه گیری pH.. 61

 

 

3-10-3- آزمون اسیدیته. 62

 

 

3-10-4- آزمون مواد جامد محلول. 62

 

 

3-10-5- آزمون اندازه گیری الکل. 62

 

 

3-11- مدل سازی.. 64

 

 

3-12- روش آماری تحلیلی داده ها 64

 

 

فصل چهارم

 

 

4-1- اندازه گیری ترکیبات خارک… 66

 

 

4-2- جداسازی وشناسایی فلور اسید استیکی نمونه های سرکه. 67

 

 

4-2-1- بررسی خصوصیات ظاهری پرگنه ها 67

 

 

4-2-2- آزمون های ابتدایی شناسایی (تایید اسید استیک باکتریایی بودن جدایه ها) 67

 

 

4-2-3- شناسایی جدایه ها در سطح جنس و گونه. 68

 

 

4-3- انتخاب جدایه های باکتری اسید استیک…. 70

 

 

4-3- تکنولوژی تولید سرکه. 73

 

 

4-3-1- آزمون های میکروبی.. 73

 

 

4-3-1-1- تغییرات رشد سلولی مخمر Saccharomyces cerevisiae. 73

 

 

4-3-1-2- تغییرات رشد سلولی باکتری های اسید استیکی.. 77

 

 

4-3-2- آزمون های شیمیایی.. 82

 

 

4-3-2-1-تغییرات pH نمونه های سرکه. 82

 

 

4-3-2-2-تغییرات اسیدیته نمونه های سرکه. 86

 

 

4-3-2-3- تغییرات مواد جامد محلول نمونه های سرکه. 90

 

 

4-3-2-4-تغییرات الکل نمونه های سرکه. 92

 

 

4-4- مدل سازی.. 97

 

 

4-4-1- مدل سازی رشد میکروبی.. 97

 

 

4-4-2- مدل سازی عوامل موثر بر تخمیر. 100

 

 

فصل پنجم

 

 

5-1- نتیجه گیری.. 111

 

 

5-2- پیشنهادات… 114

 

 

منابع.. 115

 

 

پیوست… 127

 

 

 

 

 

جدول 1-1- واکنش مخمرها طی فرآیند تخمیر الکلی.. 5

 

 

جدول 1-2- ترکیبات تشکیل دهنده خرما 8

 

 

جدول 1-3- طبقه بندی دوازده جنس خانواده Acetobacteriacea. 11

 

 

جدول 1-4- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 16

 

 

جدول 1- 5- مدل های پیشبینی رشد میکروبی.. 23

 

 

جدول 2-1- شناسایی جدایه های باکتری اسید استیکی طی اسیدیفیکاسیون سرکه توسط تکنیک های متفاوت    29

 

 

جدول2-2- مدل های آزمایشی برای تخمیر سرکه آناناس با استفاده از yeast-S. cerevisiae M30  و AAB-A. aceti WK.. 34

 

 

جدول 3-1- لیست مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش…. 41

 

 

جدول 3-2- لیست مواد ژنتیکی مورد استفاده در این پژوهش…. 42

 

 

جدول 3-3- لیست تجهیزات مورد استفاده در این پژوهش…. 42

 

 

جدول 3-4- میزان مواد استفاده شده در واکنش PCR.. 55

 

 

جدول3-5- مراحل انجام واکنش PCR.. 56

 

 

جدول 3-6- نحوه تیماربندی جهت افزودن سوسپانسیون های مخمر و باکتری.. 61

 

 

جدول 4-1- ترکیبات اصلی خارک خرما رقم “هلیله ای”. 67

 

 

جدول 4-2 جدایه های مورد استفاده در واکنش PCR.. 69

 

 

جدول 4-3- مقایسه میزان اسیدیته و pH 30 جدایه اسید استیکی.. 71

 

 

جدول 4-4- مقایسه میزان رشد، مصرف الکل، اسیدیته و pH 12 جدایه اسید استیکی.. 72

 

 

جدول 4-5- نتایج حاصل از توالی یابی جدایه ها 73

 

 

جدول 4-6- مقایسه میانگین شمارش مخمر در طول 15 روز نگهداری.. 75

 

 

جدول 4-7- مدل سازی رشد مخمر طی تخمیر الکلی سرکه خارک خرما 98

 

 

جدول 4-8- مدل سازی رشد باکتری های اسید استیکی طی تخمیر استیکی سرکه خارک خرما 99

 

 

جدول 4-9- مدل های ارائه شده برای تغییرات بریکس با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 104

 

 

جدول 4-10- مدل های ارائه شده برای تغییرات pH با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 105

 

 

جدول 4-11- مدل های ارائه شده برای تغییرات اسیدیته با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 106

 

 

جدول 4-12- مدل های ارائه شده برای تغییرات الکل با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 107

 

 

جدول 4- 13- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات بریکس…. 108

 

 

جدول 4- 14- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات pH.. 108

 

 

جدول 4- 15- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات اسیدیته. 109

 

 

جدول 4- 16- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات الکل.. 109

 

 

شکل 3-1- روش کشت سطحی.. 51

 

 

شکل 3-2- مراحل جداسازی جدایه های باکتریایی.. 53

 

 

شکل 3-3- مرحله تخمیر الکلی تولید سرکه خارک خرما 58

 

 

شکل 3-4- مرحله اسیدیفیکاسیون تولید سرکه خارک خرما 60

 

 

شکل 3-5- اندازه گیری الکل نمونه ها 63

 

 

شکل 4-1- تصویر محصولات PCR در ژل الکتروفورز. 70

 

 

شکل 4-2- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 20 درصد خارک خرما طی 15 روز  79

 

 

شکل 4-3- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 30 درصد خارک خرما طی 15 روز  80

 

 

شکل 4-4- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 40 درصد خارک خرما طی 15 روز  80

 

 

شکل 4-5- تغییرات pH در مرحله تخمیر الکلی.. 82

 

 

شکل 4-6- تغییرات pH در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 84

 

 

شکل 4-7- تغییرات اسیدیته در مرحله تخمیر الکلی.. 86

 

 

شکل 4-8- تغییرات اسیدیته در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 88

 

 

شکل 4-9- تغییرات مواد جامد محلول طی تخمیر الکلی و استیکی در غلظت 20 درصد خارک خرما طی 15 روز  90

 

 

شکل 4-10- تغییرات مواد جامد محلول با استفاده از جدایه های استیکی در غلظت 30 درصد خرما طی 15 روز  91

 

 

شکل 4-11- تغییرات مواد جامد محلول با استفاده از جدایه های استیکی در غلظت 40 درصد خرما طی 15 روز  91

 

 

 

 

 

شکل 4-12- تغییرات الکل در مرحله تخمیر الکلی.. 93

 

 

شکل 4-8- تغییرات الکل در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 94

 

 

 

 

 

پیوست “الف”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان مواد جامد محلول (TSS)  128

 

 

پیوست “ب”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان pH.. 129

 

 

پیوست “ج”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان اسیدیته. 130

 

 

پیوند “د”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان الکل.. 131

 

 

پیوست “ه”- مقایسه میانگین شمارش باکتری های استیکی در طول 15 روز نگهداری.. 132

 

 

پیوست “و”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter pasteurianus در NCBI منطبق با توالی جدایه FR22  133

 

 

پیوست “ز”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR22 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 134

 

 

پیوست “ح”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter aceti در NCBI منطبق با توالی جدایه FR43  135

 

 

پیوست “ط”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR43 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 136

 

 

پیوست “ی”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter tropicalis در NCBI منطبق با توالی جدایه FR61  137

 

 

پیوست “ک”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR61 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 138

 

 

فصل اول

 

 

 

 

 

مقدمه و کلیات

 

 

 

 

 

 

 

 

     1- مقدمه

 

 

سرکه فرآورده­ای است که از مواد مختلف قندی و نشاسته­ای از طریق تخمیر الکلی و استیکی تهیه می­شود. سرکه می­تواند از مواد خام مختلف و با روش­های متفاوت تولید گردد. در گذشته از سرکه به­عنوان نگهدارنده استفاده می­شد به­طوری که یا به­صورت طبیعی در ماده غذایی تولید می­گردید و یا به آن اضافه می­شد تا از رشد میکروبی نامطلوب در ماده غذایی جلوگیری کرده و ویژگی­های حسی آن را حفظ نماید (دی اوری و همکاران، 2002). استیک اسید یک طعم­دهنده و ترکیب ضد­میکروبی در سرکه می­باشد. همچنین مطالعاتی در زمینه اهمیت اسید استیک به­عنوان یک افزودنی غذایی جهت کمک به فرآیندهای غذایی به­منظور از بین بردن آلودگی قبل از توزیع و مصرف انجام گرفته است (مارشال و همکاران، 2000).