2-1 تعریف لایه­نشانی 28

 

2-2 تاریخچه لایه­های نازک 28

 

2-3 تقسیم بندی لایه­ها از نظر ضخامت 29

 

2-4 تقسیم بندی لایه­ها بر اساس رسانایی 30

 

2-5 عوامل مؤثر در کیفیت لایه­های نازک 30

 

2-6 فرایندهای لایه­نشانی 31

 

2-6-1  فرایند تبخیر فیزیکی 31

 

2-6-2 روش پراکنشی (کند و پاش) 32

 

2-6-3 تبخیر با باریکه الکترونی(E.Beam) 33

 

فصل سوم : تبدیل فوریه ، تبدیل فوریه­ی زمان کوتاه و تبدیل موجک 35

 

مقدمه 36

 

3-1 تبدیل فوریه و تبدیل فوریه­ی زمان کوتاه (پنجره) 37

 

3-2 تبدیل موجک 40

 

3-3 مقیاس گذاری 43

 

3-4  انتقال 43

 

3-2-1 تبدیل موجک پیوسته CWT 44

 

3-2-2 تبدیل موجک گسسته DWT 47

 

فصل چهارم : بحث و نتایج 49

 

مقدمه 50

 

4-1 مواد و روش ساخت 51

 

4-1-1 مواد آزمایش 51

 

4-1-2 روش ساخت 51

 

4-2 بكارگیری موجك درتصاویر SEM 53

 

4-2-1 پارامتر مقیاس 53

 

4-2-2 انتخاب تبدیلات موجک 54

 

4-2-3 ویژگی خانواده­ی تبدیلات موجک 54

 

4-2-4 پروفایل نماینده 54

 

4-2-5 پردازش تصویر 55

 

4-2-6 تحلیل داده با استفاده از نمودار 59

 

4-2-7 معرفی نمودارها 59

 

4-2-8 رسم  نمودار داده­های مربوط به جزئیات 59

 

4-2-9 رسم  نمودار تقریب مرتبه سوم 61

 

منابع                                                                                                                        . 64

 

فهرست اشکال

 

شکل 1-1 دسته بندی کلی روش­های وآنالیز مواد 7

 

شكل 1-2  انواع شکل­های سوزن شامل نوك تخت، نوك كروی، نوك T شكل و نوك تیز 8

 

شكل 1-3 سمت چپ:  نمایش نمادین بزرگی تغییرات نیروی بین سوزن و سطح در فواصل مختلف سوزن از سطح سمت راست: انحراف تیرك حین رفت و برگشت در نواحی مختلف فاصله از سطح (نیروی جاذبه یا دافعه). 9

 

شکل 1-4 مقایسه نمادین بین حالت تماسی و حالت غیرتماسی 10

 

شکل 1-5 تصویر (a)یک قطعه پیزوالکتریک (b)پروب (سوزن) 12

 

شکل 1-6  طرحی از یک میکروسکوپیک الکترونی 14

 

شکل 1-7 شماتیك اصول عملكرد  AFM 15

 

شکل 1-8 ساختار هندسه سه بعدی واحدهای حافظه  CD تهیه شده توسط   AFM (هر واحدافقی نمودار 250 نانومتر و درجه عمودی 75 نانومتر) 16

 

شکل 1-9 تصویر یک نوع میکروسکوپ نیروی اتمی 17

 

شکل 1-10 تصویر الكترونی روبشی سطح یك فلز با مقیاس یك میكرون اجزاء اصلی و حالت كاری یك SEM  ساده 19

 

شکل 1-11 (a) طرحی از یک میکروسکوپیک الکترونی (b) شکل واقعی میکروسکوپ الکترونی 20

 

شکل1-12 نمودار شماتیكی اجزاء اصلی یك میكروسكوپ الكترونی روبشی 20

 

شکل 1-13 نمایش نمادین اجزای اصلی و اصول عملكرد دستگاه STM 23

 

شکل 1-14 مسیر سوزن در مد جریان ثابت 24

 

شکل1-15ساختاراتمی یك نانوتیوب تك جداره کربن توسطSTM 25

 

شکل 2-1 طرحی از یک دستگاه کندوپاش 33

 

شکل 2-2 تصویر دستگاه کندوپاش تبخیر فیزیکی 34

 

شکل 3-1 روند تبدیل فوریه­ی زمان كوتاه 38

 

شکل 3-2 نمایش تبدیل  فوریه­ی زمان کوتاه یک سیگنال. طول پنجره زمانی در طول کل زمان سیگنال ثابت است. 40

 

 

شکل 3-3  تفکیک سیگنال به موجک­های مادر تشکیل دهنده آن با استفاده از ضرائب تبدیل موجک 41

 

شکل 3-4 نحوه عمل در تبدیل موجك 42

 

شکل 3-5 اثر scale factor بر روی یك موجك 43

 

شکل 3-6 انتقال یك موجك 43

 

شكل 3-7 مرحله دوم تبدیل موجك پیوسته 46

 

شکل 3-8 مرحله سوم تبدیل موجك پیوسته 46

 

شکل 3-9 مرحله چهارم تبدیل موجك پیوسته 46

 

شكل 3-10 نمایشی از قدرت تفکیک زمان و بسامد 48

 

شكل 4-1 تصویر SEM لایه نازک مگهمایت در دمای ℃600…. 53

 

شکل 4-2 جزئیات مرتبه اول D1، دوم D2 ، سوم D3 و تقریب A3 از پروفایل نمایندة مربوط به دمای ℃ 400………………….. 56

 

شکل 4-3 جزئیات مرتبه اول D1، دوم D2 ، سوم D3 و تقریب A3 از پروفایل نمایندة مربوط به دمای ℃ 500………………….. 57

 

شکل 4-4 جزئیات مرتبه اول D1، دوم D2 ، سوم D3 و تقریب A3 از پروفایل نمایندة مربوط به دمای ℃ 600………………….. 58

 

شكل 4-5 مقایسه جزئیات مرتبه 1 تصاویر SEM لایه­های نازک مگهمایت در دماهای℃ 400،℃ 500،℃600 59

 

شكل 4-6 مقایسه جزئیات مرتبه 2 تصاویر SEM لایه­های نازک مگهمایت در دماهای℃ 400،℃ 500،℃600………………………. 60

 

شكل 4-7 مقایسه جزئیات مرتبه 3 تصاویر  SEM لایه­های نازک مگهمایت در دماهای℃ 400،℃ 500،℃600………………………. 60

 

شكل 4-8 نمایش تغییرات پروفایل داده­های تصاویر نانو ذرات مگهمایت در دماهای℃ 400، ℃ 500، ℃600 62

 

فصل اول

 

طبقه­ بندی روش­های تعیین مشخصات مواد براساس نحوه عملكرد

 

طبقه­بندی روش­های تعیین مشخصات مواد براساس نحوه عملكرد[4-1].

 

مقدمه:

 

پیشرفت­های اخیر در فناوری نانو مربوط به توانایی­های جدید در زمینه اندازه­گیری و كنترل ساختارهای منفرد در مقیاس نانو می­باشد.

 

در علوم مختلف مهندسی، موضوع اندازه­گیری و تعیین مشخصات از اهمیت كلیدی برخوردار است به طوری كه ویژگی­های فیزیكی و شیمیایی مواد، به مواد اولیه­ی مورد استفاده و همچنین ریزساختار یا ساختار میكروسكوپی به دست آمده از فرایند ساخت بستگی دارد.

 

به عنوان مثال برای شناسایی مواد ، بدیهی است كه نوع و مقدار ناخالصی­ها، شكل و توزیع اندازه ذرات، ساختار بلورین و مانند آن در ماهیت و مرغوبیت محصول اثر دارند.

 

در ضمن برای مطالعه ریزساختارها، نیاز بیشتری به ابزارهای شناسایی و آنالیز وجود دارد. در ریزساختار یا ساختار میكروسكوپی مواد، باید نوع فازها، شكل، اندازه، مقدار و توزیع آن­ها را بررسی كرد. در ادامه با توجه به اهمیت دستگاه­ها و روش­های اندازه­گیری و تعیین مشخصات به طبقه­بندی این روش­ها پرداخته می­شود.

 

-1 روش­های میكروسكوپی

 

با استفاده از روش­های میكروسكوپی تصاویری با بزرگنمایی بسیار بالا از ماده بدست می­آید. قدرت تفكیك تصاویر میكروسكوپی با توجه به كمترین قدرت تمركز اشعه محدود می­شود. به عنوان مثال با استفاده از میكروسكوپ­های نوری با قدرت تفكیكی در حدود 1 میكرومتر و با استفاده از میكروسكوپ­های الكترونی، و یونی با قدرت تفكیك بالا در حدود یك آنگسترم قابل دسترسی است. این روش­ها شامل TEM،AFM ،SEM ،STM می­باشد[6،5].

 

1-2 روش­های براساس پراش

 

پراش یكی از خصوصیات تابش الكترومغناطیسی می­باشد كه باعث می­شود تابش الكترومغناطیس در حین عبور از یك روزنه و یا لبه منحرف شود. با كاهش ابعاد روزنه به سمت طول موج اشعه الكترومغناطیسی اثرات پراش اشعه بیشتر خواهد شد. با استفاده از پراش اشعه ایكس، الكترونها و یا نوترونها و اثر برخورد آن­ها با ماده می­توان ابعاد كریستالی مواد را اندازه­گیری كرد. الكترونها  و نوترونها  نیز خواص موجی دارند كه طول موج آن به انرژی آن­ها بستگی دارد. علاوه بر این هر كدام از این روش­ها خصوصیات متفاوتی دارند. مثلا عمق نفوذ این سه روش در ماده به ترتیب زیر می­باشد. نوترون از اشعه ایكس بیشتر و اشعه ایكس از الكترون بیشتر می­باشد.

 

1-3 روش­های طیف سنجی

 

استفاده از جذب، نشر و یا پراش امواج الكترومغناطیس توسط اتم­ها و یا مولكول­ها را طیف سنجی گویند. برخورد یك تابش با ماده می­تواند منجر به تغییر جهت تابش و یا تغییر در سطوح انرژی اتم­ها و یا مولكول­ها شود، انتقال از تراز بالای انرژی به تراز پایینتر، نشر و انتقال از تراز پایین انرژی به تراز بالاتر، جذب نامیده می­شود. تغییر جهت تابش در اثر برخورد با ماده نیز منجر به پراش تابش می­شود.

 

طیف سنجی جرمی

 

روش­های طیف سنجی جرمی از تفاوت نسبت جرم به بار اتم­ها و یا مولكول­ها استفاده می­کنند. عملكرد عمومی یك طیف سنجی جرمی بصورت زیر است:

 

1 – تولید یون­های گازی

 

2 – جداسازی یون­ها براساس نسبت جرم به بار

 

3 – اندازه­گیری مقدار یون­ها با نسبت جرم به بار ثابت

 

3-1- مقدمه ………………………………………………………………………………………………………….. 27

 

3-2- زیرگروه‌های T– فازی ناهموار بالایی و پایینی ……………………………………………………….. 28

 

3-3- تصویرهای همریختی گروهی از زیر گروه‌های T– فازی ناهموار …………………………………. 33

 

فصل 4: مجموعه های ناهموار در حلقه ها

 

4-1- مقدمه ………………………………………………………………………………………………………….. 37

 

4-2- روابط همنهشتی قوی و كامل و مجموعه‌های ناهموار ………………………………………………… 38

 

4-3- تقریب‌های مجموعه فازی …………………………………………………………………………………. 44

 

4-4- ایده‌آل‌های اول (اولیه) ناهموار در حلقه‌ی جابجایی ………………………………………………….. 47

 

4-5- ایده‌آل‌های فازی اول (اولیه) از یك حلقه‌ی جابجایی ……………………………………………….. 54

 

4-6- ایده‌آل‌های فازی اول ناهموار …………………………………………………………………………….. 56

 

4-7- ایده‌آل‌های ناهموار فازی…………………………………………………………………………………… 60

 

پیوست A ……………………………………………………………………………………………………………… 79

 

پیوست B ……………………………………………………………………………………………………………… 83

 

منابع ……………………………………………………………………………………………………………………. 87

 

1-1- مقدمه

 

در این فصل برخی مفاهیم و نتایج در مورد مجموعه‌های ناهموار و مجموعه‌های ناهموار (فازی) كه در سایر فصول مورد استفاده قرار می‌گیرد را ارائه می‌كنیم.

 

برای كسب اطلاعات جامع‌تر در مورد این مفاهیم به [2] و [3] و [6] و [1] و [15] مراجعه شود.

 

1-2- مجموعه‌های ناهموار

 

1-2-1- یادآوری

 

– به گردایه‌ای از اشیاء دوبدو متمایز مجموعه گوئیم.

 

– اگر A,B دو مجموعه باشند به  ضرب دكارتی A در B گوییم.

 

– هر زیر مجموعه‌ی   یك رابطه از  A به B نامیده می‌شود. اگر A=B باشد، به هر زیر مجموعه   یك رابطه روی A گفته می‌شود. اگر R رابطه‌ای روی  A باشد و  می‌نویسیم aRb.

 

– اگر R رابطه‌ای روی A باشد، وارون R به ‌صورت  و متمم R به ‌صورت  نمایش داده می‌شود.

 

– رابطه‌ی R روی مجموعه‌ی A بازتابی است یعنی:   

 

– رابطه‌ی R روی مجموعه‌ی A تقارنی است یعنی: 

 

– رابطه‌ی R روی مجموعه‌ی A ترایایی است یعنی:

 

– رابطه‌ی R روی مجموعه‌ی A هم‌ارزی است یعنی، بازتابی، تقارنی و ترایایی است.

 

– اگر R رابطه‌ی هم‌ارزی روی مجموعه A باشد، به   كلاس هم‌ارزی a یا كلاس هم‌ارزی R تولید شده توسط a گوییم.

 

– فرض كنید U یك مجموعه‌ی مرجع ناتهی باشد. مجموعه‌ی توانی U را با P(U) نمایش می‌دهیم.

 

– برای هر ، متمم مجموعه‌ی X را با X^C نشان می‌دهیم، كه به‌صورت UX تعریف می‌شود.

 

1-2-2- تعریف [1]

 

زوج  كه در آن  و  یك رابطه‌ی هم‌ارزی روی U است، یك فضای تقریب نامیده می‌شود.

 

1-2-3- تعریف [1]

 

فرض کنید  یک فضای تقریب دلخواه باشد، برای تعریف تقریب ناهموار، نگاشت  را تعریف می‌كنیم، با ضابطه‌‌ی:

 

 

 می باشد كه به‌ طوریكه  و  را تقریب ناهموار پایینی از X در  می‌نامیم و  را تقریب ناهموار بالایی از X در   می‌نامیم.

 

1-2-4- تعریف [1]

 

برای هر فضای تقریب ،  مجموعه‌ی ناهموار نامیده می‌شود اگر و تنها اگر برای بعضی از ، .

 

1-2-5- مثال

 

فرض كنید  یك فضای تقریب باشد، به‌طوریكه:

 

 و رابطه‌ی هم‌ارزی  با كلاس‌های هم‌ارزی زیر داده

 

شده باشد:

 

اگر  یک مجموعه باشد آنگاه  و و بنابراین  یك مجموعه‌ی ناهموار است.

 

1-2-6- مثال

 

فرض كنید یك فضای تقریب باشد به طوری كه  و رابطه‌ی هم‌ارزی  به صورت زیر باشد.

 

اگر I={0.1.2.3.4.6.10.11} باشد آنگاه و .

 

1-2-7- تعریف [1]

 

2-2-3- محیط کشتSNA  (Synthetic Nutrient-poor Agar)                                18

 

2-2-4- محیط کشت Nash & Snyder                                                           19

 

2-2-5- محیط کشت برگ میخک- آگار (CLA)                                                         20

 

2-2-6- محیط خاک                                                                                 20

 

2-2- 7- محیط PDB                                                                               20

 

2-3- روش جداسازی قارچها                                                                       21

 

2-3-1- استفاده از محیط کشت PDA‌                                                            21

 

2-3-2- استفاده از محیط کشتNash & Snyder                                                          21

 

2-4- روش خالص سازی قارچها                                                                  21

 

2-4-1- روش تک اسپور کردن (Single sporing)                                              21

 

2-5- روش نگهداری کشت خالص قارچها                                                       22

 

2-5-1 روش استفاده از محیط خاک                                                               23

 

2-6- روش وادارسازی قارچها به اسپورزایی                                                      23

 

2-6-1- روش استفاده از محیط CLA                                                                            23

 

2-7- روش وادارسازی قارچها به تولید کلامیدوسپور                                            24

 

2-8- نحوه تشخیص قارچها                                                                        24

 

2-9- آزمایشات گلخانه‌ای                                                                          24

 

2-9-1- روش تهیه مایه تلقیح (Inoculum) جهت اثبات بیماریزایی قارچهای فوزاریوم در گلخانه 24

 

2-9-2- روش تهیه ماسه، خاک و کود سترون جهت آزمایش‌های گلخانه‌ای                            25

 

2-9-3- اثبات بیماریزایی قارچهای فوزاریوم در گلخانه                                         25

 

2-9-4- روش تهیه مایه تلقیح جهت اثبات بیماریزایی قارچهای غیر فوزاریوم در گلخانه   26

 

2-9-5- اثبات بیماریزایی قارچهای غیر‌فوزاریوم با روش تلقیح میسلیومی در گلخانه                  26

 

2-9-6- کشت گیاهان جهت مایه‌زنی                                                              26

 

2-9-7- مایه زنی گیاهچه ها با سوسپانسیون قارچ و تعیین مقاومت ارقام                     26

 

2-9-8- نقشه اجرای آزمایش                                                                      27

 

فصل سوم: نتایج

 

3-1- گونه های جمع آوری شده                                                                   29

 

3-1-2- توصیف جنس Fusarium                                                                31

 

3-1-2- شرح گونه های فوزاریوم جمع آوری شده                                              33

 

 

1. oxysporum                                     33

 

1. redolens 35

 

1. foetens 36

 

1. reticulatum 38

 

1. sambucinum 40

 

1. pallidoroseum 43

 

1. camptoceras 44

 

1. solani 46

 

1. javanicum 48

 

1. petroliphilum 49

 

1. acutatum 51

 

3-1-4- شرح گونه های غیر فوزاریوم                                                             52

 

 Bipolaris sorokiniana                                                                                     52

 

Alternaria alternate                                                                                                     53

 

3-2- نتایج آزمایشات گلخانه‌ای                                                                             55

 

3-2-1- نتایج آزمون بیماریزایی در گلخانه                                                        55

 

3-2-2- عامل بیماری                                                                                56

 

3-2-3- موقعیت تاکسونومی                                                                       56

 

3-2-4- علائم و مراحل آلوده سازی                                                              57

 

3-2-5- دامنه میزبانی                                                                                57

 

3-2- 6- انتشار                                                                                                58

 

3-2-7- بقاء                                                                                          58

 

3-2-8- نتایج ارزیابی مقاومت ارقام نخود                                                                 58

 

فصل چهارم: بحث

 

4-1- شناسایی قارچها                                                                                84

 

4-2- تست بیماریزایی                                                                               84

 

4-3- ارزیابی مقاومت ارقام                                                                          84

 

4-4- پیشنهادات                                                                                               85

 

منابع مورد استفاده                                                                                     86

 

مقدمه

 

حبوبات دانه‌های خشک خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند. بذور رسیده و خشک حبوبات دارای ارزش غذایی زیاد و قابلیت نگهداری خوبی هستند و یکی از مهمترین منابع غذایی ‌سرشار ‎از‌‌‌‌‌ پروتئین می‌باشند (باقری و همکاران، 1376). پس از غلات، دومین منبع مهم غذایی بشر، حبوبات است. این گیاهان متعلق به خانواده‌ی بقولات (Fabaceae) و زیرخانواده پروانه‌آسایان (Papilionoidea) هستند (کوچکی و بنایان اول، 1386). حبوبات با بر آوردن نیازهای پروتئینی انسان و در نتیجه کاهش فشار بر چراگاه‌های طبیعی برای تولید پروتئین‌های دامی، نقش انکار ناپذیری در حفظ اکوسیستم های طبیعی دارند. نخود با نام علمی Cicer aritinum L گیاهی است که علاوه بر تأمین پروتئین گیاهی، توانایی افزایش حاصلخیزی خاک را دارد که نیاز به مصرف کود شیمیایی و سموم دفع آفات را به حداقل می‌رساند (امینی زاده و همکاران، 1392).

 

حبوبات به دلیل پروتئین بالا و اسیدهای آمینه ضروری محصولات زراعی مهمی هستند دانه حبوبات در مقایسه با غلات محتوی پروتئین بیشتری است. مقدار پروتئین موجود در بذور حبوبات (25-20%) در مقایسه با غلات (10-6%) است. حبوبات به طور معمول سرشار از پروتئین، کربوهیدرات‌های پیچیده، فیبر و مقدار کمی روغن هستند (Akibode, 2011). همچنین مقدار پروتئین موجود در دانه حبوبات 10‌تا‌20 برابر بیشتر از پروتئین موجود در گیاهان غده‌ای بوده، درحال حاضر حدود 90 درصد از کالری ‌‌و ‌75 درصد از پروتئین مورد نیاز انسان از منابع گیاهی تامین می‌شود که در این میان حبوبات نقش مهمی را دارا می‌باشد (مجنون حسینی، 1387). این گیاهان منبع مهم ویتامین‌هایی مانند ریبوفلاوین، ویتامین ب و کاروتن هستند و از لحاظ اسیدهای آمینه ضروری مخصوصاً لیزین، که کمبود آن در غلات وجود دارد غنی هستند. از طرف دیگر با توجه به توانایی تثبیت ازت در این گیاهان قرار‌دادن آنها در تناوب زراعی به پایداری سیستم‌های زراعی کمک می‌کند (Singh et al.,1989).

 

حدود 680 هزار هكتار معادل 6/5 درصد از اراضی محصولات سالانه برداشت شده در سال زراعی 90- 1389 به حبوبات اختصاص یافته است. از این مقدار نخود 3/61 درصد، از سطح برداشت را به خود اختصاص داده است. استان لرستان با تولید 80 هزار و 955 تن نخود مقام نخست تولید کشور را دارد (آمارنامه کشاورزی، 1390-1389‌).

 

نخود یکی از مهمترین محصولات در حال رشد در ایران و جهان است اما عملکرد و کیفیت نخود تحت تاثیر پژمردگی ناشی ازFusarium oxysporum. Schl. f. sp. ciceri (Padw) Matuo & K. Sato قرار می‌گیرد. کاهش عملکرد نخود به علت پژمردگی ناشی از قارچ فوزاریوم تا 90 درصد گزارش شده است. این بیماری تقریباً در تمام مناطق زیر‌کشت حبوبات از جمله، شبه قاره هند، ایران، پرو، سوریه ، اتیوپی مکزیک، اسپانیا، تونس، ترکیه و آمریکا شایع است (Lal and Datta, 2013). کاهش عملکرد نخود به علت پژمردگی فوزاریومی در هند و اسپانیا 10درصد، در تونس 40 درصد و در ایران 17درصد گزارش شده است (Karimi et al.,2012). پژمرده و زرد شدن برگ‌ها، ضعف بوته، کاهش تعداد غلاف، کوچک ماندن دانه‌‌ها و در نتیجه کاهش محصول از نشانه‌های این بیماری هستند. عامل بیماری قارچ خاکزاد F. oxysporum f. sp. ciceri است. خسارت این بیماری در بعضی از مزارع اطراف مراغه تا ۸۰ درصد گزارش شده است (ولادی و همکاران، 1391).

 

علایم این بیماری هم در مراحل ابتدایی رشد گیاه و هم در مراحل مختلف بلوغ قابل رویت است. علائمی از قبیل کوتولگی، کوچک‌ شدن برگها، آویختگی برگ و بالاخره مرگ گیاه را موجب می‌شود.(Stoilova and Chavdarov, 2006)

 

هشت نژاد ازF. oxysporum  تا کنون گزارش شده است که شش نژاد (1A, 2, 3, 4, 5 and 6) باعث علائم پژمردگی و از نظر اقتصادی مهمتر هستند نسبت به نژادهای0  و 1B/C که باعث علائم زردی می‌شوند (Lal and Datta, 2013 ؛Karimi et al.,2012  ؛ Jimenez-Gasco and Jimenez-Diaz, 2002).

 

نژادهای 2، 3 و4، فقط از هند گزارش شدند.0 ،1B/C ،5  و6 از ناحیه مدیترانه و آمریکا‌ (کالیفرنیا) و نژاد1A  از هند، کالیفرنیا و حوزه مدیترانه گزارش شدند (Jimenez-Gasco and Jimenez-Diaz, 2002).

 

اهداف

 

1- مطالعه سبب شناسی عوامل زردی و پژمردگی نخود

 

2- شناسایی عوامل زردی و پژمردگی نخود در استان لرستان

 

3- تعیین مقاومت ارقام نخود به عوامل پژمردگی و زردی

 

4- مقایسه میانگین ها برای تمامی صفات مورد مطالعه ارقام نخود از نظر مقاومت به بیماری زردی و پژمردگی

 

5- بررسی میزان خویشاوندی ارقام نخود از نظرمقاومت به بیماری زردی و پژمردگی

 

فرضیه ها

 

1– زردی و پژمردگی نخود عامل قارچی ندارد.

 

2- ارقام نخود نسبت به عوامل پژمردگی و زردی مقاوم نیستند.

 

3– عامل زردی و پژمردگی نخود قارچ فوزاریوم نیست.

 

4- میانگین صفات مورد مطالعه ارقام نخود از نظر مقاومت به بیماری زردی و پژمردگی اختلاف معنی داری ندارند.

 

5- ارقام نخود از نظر مقاومت به بیماری زردی و پژمردگی خویشاوندی ندارند.

 

هدف ما از انجام این تحقیق شناسایی عوامل بیماری زردی و پژمردگی نخود و تعیین ارقام مقاوم نخود نسبت به این بیماری در شرایط گلخانه در استان لرستان می‌باشد. 

 

1-1- کلیات

 

1-1-1- سطح زیر‌کشت و تولید نخود در ایران

 

در سال زراعی 90-89 سطح زیر‌کشت و میزان تولید نخود به ترتیب برابر با 5/419 هزار هکتار و 6/233 هزار‌ تن بوده است. محصول نخود به دو صورت آبی و دیم در ایران کشت می‌شود که 6/97 درصد از سطح زیر‌کشت و 4/93 درصد از تولید این محصول به صورت دیم است (آمارنامه کشاورزی، 1390) (جدول1-1).

 

جدول 1-1- سطح زیر کشت و میزان تولید نخود در ایران (سال زراعی 1390-1389)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

سطح زیر کشت (هکتار)			سهم ‌از سطح زیرکشت		تولید (تن)			سهم از تولید
آبی	دیم	مجموع	آبی	دیم	آبی	دیم	مجموع	آبی	دیم
10221	409276	419497	4/2	6/97	17/15434	1/218252	3/233686	6/6	4/93

 

جدول 1-2- وضعیت تولید نخود در استانهای تولید کننده ( 1390- 1389)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

استان	سطح‌‌زیر کشت	سهم سطح زیر کشت	تولید	سهم تولید
آذربایجان شرقی	40421	6/9	2/26976	5/11
آذزبایجان غربی	72036	2/17	2/29869	8/12
اردبیل	4089	1	2/2765	2/1
ایلام	5012	2/1	7/3731	6/1
فارس	3342	8/0	3/4942	2/1
کردستان	72010	2/17	4/29512	6/12
زنجان	4154	1	4/1165	5/0
خراسان رضوی	8320	2	1/3173	4/1
خراسان شمالی	2286	5/0	6/903	4/0

 

2

 

 

1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی…………………….

 

 

 

3

 

 

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….

 

 

 

4

 

 

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا ……………………………………………………..

 

 

 

4

 

 

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی…………………………………………………

 

 

 

6

 

 

1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف………………………………………..

 

 

 

7

 

 

1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان………………………..

 

 

 

10

 

 

1-1-5 سلول­های مغز استخوان ……………………………….

 

 

 

10

 

 

1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز…………………………..

 

 

 

11

 

 

1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان……………………………..

 

 

 

12

 

 

1-2  تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ………………………………..

 

 

 

13

 

 

1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………..

 

 

 

14

 

 

1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………..

 

 

 

15

 

 

1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم …………………….

 

 

 

16

 

 

1-3  کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………..

 

 

 

17

 

 

1-3-1 ترمیم استخوان ……………………………………………….

 

 

 

 

17

 

 

1-4 بافت استخوان ……………………………………………..

 

 

 

20

 

 

1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ……………………………..

 

 

 

21

 

 

1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ………………………..

 

 

 

23

 

 

1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ………………………………………………..

 

 

 

23

 

 

1-5-3 دوباره­سازی استخوان …………………………………………..

 

 

 

24

 

 

1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………..

 

 

 

25

 

 

1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ………………………………………………

 

 

 

25

 

 

1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..

 

 

 

27

 

 

1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………

 

 

 

29

 

 

1-7 عنصر بور ……………………………………..

 

 

 

30

 

 

1-7-1 مشتقات بور ………………………………………………………..

 

 

 

32

 

 

1-7-2 فراوانی عنصر بور ………………………………………

 

 

 

32

 

 

1-7-3 تاریخچه مصرف بور ………………………………..

 

 

 

33

 

 

1-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………

 

 

 

34

 

 

1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ………………………………………….

 

 

 

34

 

 

1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن …………………………………..

 

 

 

36

 

 

1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ……………………………………………………..

 

 

 

37

 

 

1-7-6 کاربرد بور در دارو ………………………………………………

 

 

 

37

 

 

1-7-7 سرطان ……………………………………………………….

 

 

 

39

 

 

1-8 اثرات بور روی استخوان …………………………………….

 

 

 

40

 

 

1-9 بور و خون ………………………………………………………..

 

 

 

41

 

 

1-10 بور در گیاهان …………………………………………………………

 

 

 

42

 

 

1-11 سمیت بور …………………………………………….

 

 

 

44

 

 

1-12 محدوده استفاده بور ………………………………………………

 

 

 

45

 

 

مروری بر مطالعات گذشته ………………………………………

 

 

 

47

 

 

هدف مطالعه ……………………………………………………………..

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل دوم: مواد و روش­ها

 

 

 

50

 

 

2-1  انتخاب رت ……………………………………………………………….

 

 

 

50

 

 

2-2 جدا سازی وتكثیر سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………..

 

 

 

52

 

 

2-2-1 اجرای پاساژ ………………………………

 

 

 

54

 

 

2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ……………………………………….

 

 

 

54

 

 

2-3-1 تمایز به استخوان …………………………………………………………….

 

 

 

55

 

 

2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ………………………………

 

 

 

55

 

 

2-4-1  رنگ آمیزی تریپان بلو ………………………………………………..

 

 

 

57

 

 

2-4-2  سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………….

 

 

 

57

 

 

2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( …………………………………………………………………..

 

 

 

58

 

 

2-4-2-2  ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم …………………………………………………

 

 

 

59

 

 

2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک …………………….

 

 

 

60

 

 

2-5  انتخاب دوز مورد نظر ………………………………………..

 

 

 

60

 

 

2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم …………….

 

 

 

61

 

 

2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ………………………………

 

 

 

63

 

 

2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………..

 

 

 

62

 

 

2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت ……………………………………………..

 

 

 

65

 

 

2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………….

 

 

 

65

 

 

2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ………………………………

 

 

 

65

 

 

2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ………………………………………

 

 

 

66

 

 

2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………….

 

 

 

66

 

 

2-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………

 

 

 

68

 

 

2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز…………………………………

 

 

 

70

 

 

2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ………………………………………………

 

 

 

72

 

 

2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک

 

 

 

72

 

 

2-8-3-1  رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………..

 

 

 

73

 

 

2-8-3-2  بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده …………………………………

 

 

 

73

 

 

2-8-4  بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………….

 

 

 

73

 

 

2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………

 

 

 

74

 

 

2-8-4-1-1 مراحل  انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..

 

 

 

75

 

 

2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم …..

 

 

 

76

 

 

2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..

 

 

 

81

 

 

2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها …………..

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل سوم: نتایج

 

 

 

82

 

 

3-1 الف: نتایج مرحله اول …………………………………

 

 

 

82

 

 

3-1-1  رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………

 

 

 

82

 

 

3-1-2  اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………

 

 

 

85

 

 

3-1-3  بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ………………

 

 

 

87

 

 

3-1-4  نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..

 

 

 

89

 

 

3-1-5  اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ……

 

 

 

91

 

 

3-1-6  میزان الکترولیتها…………………………………………..

 

 

 

92

 

 

3-2  نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..

 

 

 

92

 

 

3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………..

 

 

 

93

 

 

3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های  استئوژنیک

 

 

 

96

 

 

3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..

 

 

 

97

 

 

3-2-3-1  میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..

 

 

 

100

 

 

3-2-3-2  میزان رسوب کلسیم ……………………………………..

 

 

 

101

 

 

3-2-3-3  بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ………….

 

 

 

101

 

 

3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..

 

 

 

103

 

 

3-2-3-5  بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ………………..

 

 

 

103

 

 

3-2-3-6  بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری

 

 

 

105

 

 

4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ………………………..

 

 

 

105

 

 

4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ……………………………………………………

 

 

 

108

 

 

4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………

 

 

 

109

 

 

4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ….

 

 

 

113

 

 

4-1-4  اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ………………………………………

 

 

 

116

 

 

4-2  اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ………………………………

 

 

 

116

 

 

4-2-1 توانایی زیستی …………………………………….

 

 

 

119

 

 

4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها …………………………………………….

 

 

 

120

 

 

4-2-3  بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………….

 

 

 

124

 

 

4-2-4  بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………..

 

 

 

127

 

 

4-2-5  تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ……………………………………………..

 

 

 

128

 

 

4-3  نتیجه گیری ………………………………………………………

 

 

 

129

 

 

4-4 پیشنهادات …………………………………………………………….

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل پنجم:ضمیمه

 

 

 

131

 

 

5-1 روش تهیه محیط کشت ………………………………………………….

 

 

 

131

 

 

5-2  تهیه ی فسفات بافر سالین PBS^– …………………………….

 

 

 

132

 

 

5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS⁺………………………

 

 

 

132

 

 

5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………..

 

 

 

133

 

 

5-5  آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………

 

 

 

133

 

 

5-6  روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد …………………………….

 

 

 

133

 

 

5-7  تهیه کریستال ویولت ………………………………………

 

 

 

133

 

 

5-8 روش تهیه محلول   MTT………………………………….

 

 

 

133

 

 

5-9  روش تهیه بافر شست و شو(  ( Tris-Hcl-NaCl…………………..

 

 

 

133

 

 

5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر  استخراج ( Tris-Hcl) …………

 

 

 

134

 

 

5-11 روش تهیه بافر ARS ……………….

 

 

 

134

 

 

5-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………

 

 

 

134

 

 

5-13   روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………

 

 

 

135

 

 

5-14  روش تهیه بافر استخراج کلسیم ………………………….

 

 

 

135

 

 

5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….

 

 

تعریف سلول­های بنیادی

 

   به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

 

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1).

 

به دلیل این­که این سلول­ها منشا تولید بقیه انواع سلول­ها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار می­رود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلول­های تخصص یافته را دارد. این سلول­ها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادی تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی می­ماند. سلول­های بنیادی در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاری از سلول­ها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته می­شوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت برای جایگزینی دیگر سلول­ها را دارا می­باشند. وقتی یک سلول بنیادی تقسیم می­شود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادی باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلول­های خونی و … تمایز یابد (1).

 

 

 

 

 

شکل1-1: توانائی خودنوزائی و  پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com)

 

 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی

 

   تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند.

 

خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2).

 

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها:

 

   سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:

 

الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.

 

ب) پر توان[5]: این نوع سلول­ها قادر به ساخت غالب یا همه سلول­های فرد هستند. به عنوان مثال سلول­های بنیادی جنینی تحت شرایط خاص می­توانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلول­های جفت نیستند. سلول‌های بنیادی جنینی و سلول‌های پر توان القایی جز این دسته از سلول‌های بنیادی می‌باشند.

 

پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می­‌کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).

 

ت) یک توان[7]: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کرده­اند. مانند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).

 

 

 

شکل 1-2: دسته­بندی سلول­های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).

 

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا

 

   سلول­های بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیم­بندی می­شوند

 

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی

 

  کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلول­های بنیادی جنینی انسانی (ESCs) [8] در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.

 

سلول­های بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (ICM)[9]جنین در مرحله بلاستوسیت به دست می­آیند. بلاستوسیت مرحله­ای از تکوین پیش از لانه­گزینی در پستانداران است که معمولا چهار تا پنج روز بعد از لقاح ایجاد می­شود. در این مرحله جنین 200-100 سلول دارد و به صورت کره­ای توخالی است. این کره متشکل از یک لایه سلولی برونی (تروفواکتودرم) است که به طور معمول پس از لانه­گزینی در رحم، بخشی از جفت را می­سازد. همچنین این کره مجتمعی از سلول­ها (حدود 30-20سلول) در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است که قادرند لایه­های مختلف جنین کامل را تولید کنند (شکل 1-3) (4).

 

1‌.1‌.2‌ پاتوژنز. 3

 

1‌.1‌.3‌ ویژگی های کلینیکی وتشخیصی.. 5

 

1‌.2‌ تاریخچه خانوادگی.. 5

 

1‌.3‌ تشخیص…. 5

 

1‌.4‌ ارزیابی قبل از درمان.. 6

 

1‌.5‌ درمان.. 6

 

1‌.6‌ مکانیسم مولکولی سرطان.. 9

 

1‌.6‌.1‌ مسیر پیام رسانی TGFβ 9

 

1‌.6‌.1‌.1‌ خانواده لیگاند های TGFβ.. 11

 

1‌.6‌.1‌.2‌ رسپتور نوع 1و2 ( TGFβRI,II) 11

 

1‌.6‌.1‌.3‌ فسفریلاسیون SMAD… 12

 

1‌.6‌.2‌ تنظیم پیام رسانی TGFβ. 12

 

1‌.6‌.3‌ دخالت پیام رسانیTGFβ  در سرطان.. 13

 

1‌.6‌.4‌ ژنهای همئوباکس(Homeobox) 14

 

1‌.6‌.4‌.1‌ ساختار ژن های همئوباکس….. 14

 

1‌.7‌     نقش ژن های همئوباکس (Homeobox) در ایجاد سرطان.. 17

 

1‌.8‌ miRNA 18

 

1‌.8‌.1‌ بیوژنز miRNA ها و نحوه مهار ترجمه. 19

 

1‌.9‌ miRNA و سرطان.. 20

 

1‌.10‌ miRNA ابزاری برای شناسایی و تشخیص سرطان.. 21

 

1‌.11‌ miRNA ودرمان سرطان.. 22

 

1‌.12‌   بیان مسئله و اهمیت پژوهش…. 23

 

1‌.13‌   اهداف پژوهش…. 24

 

1‌.13‌.1‌  هدف اصلی.. 24

 

1‌.13‌.2‌  اهداف ویژه 24

 

1‌.13‌.3‌  هدف کاربردی.. 25

 

فصل 2: بررسی متون.. 26

 

2‌.1‌ بررسی متون مرتبط با موضوع. 27

 

فصل 3:مواد و روش ها 32

 

3‌.1‌ مواد شیمیایی و آنزیم ها 33

 

3‌.1‌.1‌ پلاسمیدوسویه باکتری.. 35

 

3‌.1‌.1‌.1‌ خصوصیات پلاسمید.. 36

 

3‌.1‌.1‌.2‌ خصوصیات میزبان.. 37

 

3‌.2‌ روش ها 37

 

3‌.2‌.1‌ کشت باکتری.. 37

 

3‌.2‌.1‌.1‌ مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری… 37

 

3‌.2‌.1‌.2‌ طرز تهیه محیط کشت LB مایع.. 38

 

3‌.2‌.1‌.3‌ گلیسرول استاک…. 38

 

3‌.2‌.2‌ روش انجام   miniprepاستخراج DNA  پلاسمیدی از باکتری.. 39

 

3‌.2‌.2‌.1‌ بررسی کمی وکیفی DNA پلاسمیدی… 41

 

3‌.2‌.3‌ هضم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده 45

 

3‌.2‌.4‌ کشت سلولی.. 46

 

3‌.2‌.4‌.1‌ محیط کشت…. 46

 

3‌.2‌.4‌.2‌ سرم جنینی گاوFBS.. 47

 

3‌.2‌.4‌.3‌ تهیه محیط انجاد از سلولها 47

 

3‌.2‌.4‌.4‌ خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه. 48

 

3‌.2‌.5‌ تعیین منحنی کشندگی انتی بیوتیک G418. 48

 

3‌.2‌.6‌ منطبق سازی سلولها 48

 

3‌.2‌.7‌ ترانسفکشن سلولهای Y79  با وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX.. 49

 

3‌.2‌.8‌ انتخاب سلولهای مثبت… 50

 

3‌.2‌.9‌ بررسی بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله Realtime RT-PCR                            51

 

3‌.2‌.9‌.1‌ محافظت از RNA… 52

 

3‌.2‌.9‌.2‌ استخراج RNA… 55

 

 

3‌.2‌.9‌.3‌ تیمار نمونه RNA باآنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز  I. 59

 

3‌.2‌.9‌.4‌ سنتز DNA مکمل(cDNA) 60

 

3‌.2‌.9‌.5‌ PCR(Polymerase chain reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز. 64

 

3‌.2‌.9‌.6‌ واکنش Realtime PCR… 68

 

3‌.2‌.9‌.7‌ تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR… 77

 

3‌.2‌.10‌  بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot 78

 

3‌.2‌.10‌.1‌ الکتروفورز عمودی SDS-PAGE.. 78

 

3‌.2‌.10‌.2‌ رنگ آمیزی SDS-PAGE.. 84

 

3‌.2‌.10‌.3‌ وسترن بلاتینگ….. 86

 

3‌.2‌.11‌  بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازولیوم. 90

 

3‌.2‌.11‌.1‌ بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 90

 

3‌.2‌.11‌.2‌ بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 91

 

3‌.2‌.11‌.3‌ پروتکل شمارش سلول.. 92

 

3‌.2‌.12‌  مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX, miRNA Let7g,18a,34a,22,20  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR.. 92

 

فصل 4: نتایج و یافته ها 96

 

4‌.1‌Mini prep   و هضم DNA  پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب… 97

 

4‌.2‌ بررسی بیانTGIF2LX  در سطح mRNA… 98

 

4‌.2‌.1‌ نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA.. 98

 

4‌.2‌.2‌ بررسی کیفی cDNA.. 99

 

4‌.3‌ بررسی بیان TGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده 101

 

4‌.3‌.1‌ مطالعه بیان TGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده Y79  در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ                                   101

 

4‌.3‌.2‌ تایید بیان واضح ژن GFP-TGIF2LX توسط Realtime RT- PCR.. 102

 

4‌.3‌.3‌ مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western Blot 104

 

4‌.3‌.4‌ مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل                    105

 

4‌.4‌ بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79. 105

 

4‌.4‌.1‌ نتایج ازمایش (MTT)Microculturetetrazolium Test 105

 

4‌.4‌.2‌ بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 106

 

4‌.5‌ بررسی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل.. 108

 

4‌.6‌ مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20  در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل.. 109

 

4‌.7‌ Ct در واکنش Realtime PCR.. 110

 

فصل 5: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها 113

 

5‌.1‌ بحث   114

 

5‌.2‌ تاثیر بیان افزایشی TGIF2lX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79. 116

 

5‌.3‌ تاثیر دارویSD-208  بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل  117

 

5‌.4‌ اثر SD-208 بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل                         118

 

5‌.5‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیانmiRNA های مورد مطالعه. 118

 

5‌.5‌.1‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79. 118

 

5‌.5‌.2‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79. 119

 

5‌.5‌.3‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79. 119

 

5‌.5‌.4‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی.. 119

 

5‌.5‌.5‌ اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79. 120

 

5‌.6‌ نتیجه گیری.. 120

 

       7.5 پیشنهاد ها ……………………….121

 

منابع و مراجع.. 122

 

پیوست ها 131

 

1‌.1‌          رتینوبلاستوما

 

رتینوبلاستوما یکی از سرطان های بدخیم چشمی شایع کودکی می­باشد که به دو فرم پراکنده (تک گیر) و ارثی(خانوادگی) وجود دارد [1]. تقریبا 4 درصد تومورهای کودکان را رتینو بلاستوما تشکیل می­دهد .این تومور شایعترین بدخیمی اولیه چشمی است که در غرب 99درصد کودکان از این سرطان نجات پیدا می­کنند ولی بیش از 90 درصدآنها بینایی خود را از دست می­دهند و متاسفانه در کشورهای در حال توسعه بقا کودک تقریبا 50 درصد می­باشد[2] و [3].

 

اغلب کودکان مبتلا به رتینوبلاستوما با علامت لوکوکوریا[1] (شکل ‏1‑1) که والدین آنها متوجه م­شوند مراجعه می­کنند[4].

 

 

 

 

 

1‌.1‌.1‌                                                                                      اپیدمیولوژی

 

رتینوبلاستوما تقریبا با شیوع 1 در 15000و 1 در 16600تولد زنده در امریکا و اروپای شمالی رخ میدهد [5] و [6] ودر بین سالهای 2005-2009شیوع سالیانه رتینوبلاستوما در امریکا 4.1 در هرمیلیون کودک زیر 15 سال می­باشد[5] ودر کل دنیا سالیانه 5000تا 8000 کودک مبتلا به رتینوبلاستوما می­شوند [7] به طور متوسط سن تشخیص بیماری زیر 2 سال است و تقریبا 95درصد قبل از 5 سالگی می­باشد.شیوع بیماری در بین دختر وپسر و سیاه و سفید شبیه به هم می­باشد[5].

 

تقریبا 1/4 موارد رتینوبلاستوما دو طرفه می­باشد بیماریهای دوطرفه همیشه الگوی ارثی دارند. تومور های دو طرفه زودتر در کودکان رخ می­دهد که نشان دهنده وجود موتاسیون در سلولهای زایا می­باشد. فرم ارثی رتینوبلاستوما نیازمند یک جهش ژرم لاین است که می­تواند از هر یک از والدین یا از محیط( که منجر به یک موتاسیون ژرم لاین شود) می­باشد. بر عکس فقط 15 درصد از موارد یکطرفه ارثی هستند که اغلب چند کانونی هستند و باید از نظر جهش ژرم لاین بررسی شوند که معمولا در 2سال اول زندگی رخ می­دهد کم تر از 10 درصد بیماران رتینوبلاستومایی تاریخچه مثبت خانوادگی دارند.

 

تقریبا 60 درصد کودکان با رتینوبلاستوما الگوی یک طرفه غیر ارثی دارند.کودکان با رتینوبلاستوما غیرارثی یک موتاسیون جدید در یک سلول شبکیه دارند که منجر به تومور می­شوند [8] . ناهنجاری ژنتیک در فرم ارثی رتینوبلاستوما موجب ایجاد و پیشرفت تومور مثل استئوژنیک سارکوما وسارکومای بافت نرم(بخصوص لیومیوسارکوما)و ملانومای بدخیم میشود شیوع سرطان ثانویه بعد از تشخیص رتینوبلاستوما در فرم ارثی و غیرارثی به ترتیب 51 و 5 درصد میباشد که بیش از 60 درصد سرطان ها سارکوما می­باشد [9].

 

1‌.1‌.2‌                                                                                     پاتوژنز

 

رتینوبلاستوما معمولا بوسیله غیر فعال شدن هر دو الل ژن رتینوبلاستوما رخ می­دهد.با الگوی اتوزومی غالب این ژن در ناحیه کروموزم 13 بازوی بلند در ناحیه 14قرار دارد که کد کننده یک پروتئین هسته ای با نقش تومورساپرسوری می­باشد [10].

 

مدل 2 ضربه ای که پیشنهاد شده است دلیل متفاوت بودن ویژگی های کلینیکی موارد ارثی و غیر ارثی رتینوبلاستوما را مطرح میکند[11]. (شکل ‏1‑2)

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل ‏1‑2: مدل 2  ضربه ای رتینوبلاستوما

 

در مدل ارثی در ژن RB1 یک موتاسیون در کل سلول ها وجود دارد و ضربه دوم در مراحل بعدی تکامل رخ می­دهد که این افراد مستعد رتینوبلاستومای دوطرفه و چندکانونی می­باشند.ضربه دوم می­تواند رخ دهد ویا توسط تغییرات اپی­ژنتیک خاموش شود.

 

در مدل رتینوبلاستومای غیر ارثی دو جهش در یک الل به صورت خودبه خودی در یک سلول سوماتیک شبکیه رخ میدهد که معمولا منجر به مدل کلینیکی تومور یه کانونی ویه طرفه رتینوبلاستوما می­شود [12].

 

رتینوبلاستوما اگر درمان نشود رشد میکند و جای چشم را اشغال می­کند وکره چشم را از بین میبرد و ممکن است طی 4 ماه بعد از تشخیص به مغز متاستاز بدهد و مرگ طی یک سال رخ بدهد.اغلب راههای متاستاز تومور به وسیله اپتیک نرو[3] به سیستم عصب مرکزی و یا گسترش از طریق مشیمیه به اربیت میباشد [13].

 

1‌.1‌.3‌                                                                                    ویژگی های کلینیکی وتشخیصی

 

لوکوکوریا شایعترین علامت در کودکان رتینوبلاستومایی میباشد اگر چه علایم دیگر نیز وجود دارد و لوکوکوریا برای تشخیص ضروری نیست. شایعترین علایم لوکوکوریا (54درصد) و استرابیسم (19درصد) کاهش دید (4درصد) عفونت چشمی (5درصد) و تاریخچه خانوادگی مثبت (5درصد) میباشد و موارد دیگر عنبیه هتروکروم وخونریزی ویتره و هایفما بدون ضربه و گلوکوم و سلولیت اربیت و پروپتوزیس و درد چشم و تب می­باشد [14].