2

 

 

1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی…………………….

 

 

 

3

 

 

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ……………………………………………………….

 

 

 

4

 

 

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا ……………………………………………………..

 

 

 

4

 

 

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی…………………………………………………

 

 

 

6

 

 

1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف………………………………………..

 

 

 

7

 

 

1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان………………………..

 

 

 

10

 

 

1-1-5 سلول­های مغز استخوان ……………………………….

 

 

 

10

 

 

1-1-5-1 سلول­های بنیادی خونساز…………………………..

 

 

 

11

 

 

1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان……………………………..

 

 

 

12

 

 

1-2  تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ………………………………..

 

 

 

13

 

 

1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم …………………………..

 

 

 

14

 

 

1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ……………………………………..

 

 

 

15

 

 

1-2-3 ویژگی­های اساسی سلول بنیادی مزانشیم …………………….

 

 

 

16

 

 

1-3  کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ………………..

 

 

 

17

 

 

1-3-1 ترمیم استخوان ……………………………………………….

 

 

 

 

17

 

 

1-4 بافت استخوان ……………………………………………..

 

 

 

20

 

 

1-5 استئوژنز(استخوان‌سازی) ……………………………..

 

 

 

21

 

 

1-5-1 استخوان­سازی اولیه یا جنینی ………………………..

 

 

 

23

 

 

1-5-2 استخوان­سازی ثانویه ………………………………………………..

 

 

 

23

 

 

1-5-3 دوباره­سازی استخوان …………………………………………..

 

 

 

24

 

 

1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ……………..

 

 

 

25

 

 

1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ………………………………………………

 

 

 

25

 

 

1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلول‌های بنیادی مزانشیمی ……………………………………………..

 

 

 

27

 

 

1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان …………………………

 

 

 

29

 

 

1-7 عنصر بور ……………………………………..

 

 

 

30

 

 

1-7-1 مشتقات بور ………………………………………………………..

 

 

 

32

 

 

1-7-2 فراوانی عنصر بور ………………………………………

 

 

 

32

 

 

1-7-3 تاریخچه مصرف بور ………………………………..

 

 

 

33

 

 

1-7-4 منابع طبیعی بور…………………………………

 

 

 

34

 

 

1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران ………………………………………….

 

 

 

34

 

 

1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن …………………………………..

 

 

 

36

 

 

1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها ……………………………………………………..

 

 

 

37

 

 

1-7-6 کاربرد بور در دارو ………………………………………………

 

 

 

37

 

 

1-7-7 سرطان ……………………………………………………….

 

 

 

39

 

 

1-8 اثرات بور روی استخوان …………………………………….

 

 

 

40

 

 

1-9 بور و خون ………………………………………………………..

 

 

 

41

 

 

1-10 بور در گیاهان …………………………………………………………

 

 

 

42

 

 

1-11 سمیت بور …………………………………………….

 

 

 

44

 

 

1-12 محدوده استفاده بور ………………………………………………

 

 

 

45

 

 

مروری بر مطالعات گذشته ………………………………………

 

 

 

47

 

 

هدف مطالعه ……………………………………………………………..

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل دوم: مواد و روش­ها

 

 

 

50

 

 

2-1  انتخاب رت ……………………………………………………………….

 

 

 

50

 

 

2-2 جدا سازی وتكثیر سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………..

 

 

 

52

 

 

2-2-1 اجرای پاساژ ………………………………

 

 

 

54

 

 

2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ……………………………………….

 

 

 

54

 

 

2-3-1 تمایز به استخوان …………………………………………………………….

 

 

 

55

 

 

2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ………………………………

 

 

 

55

 

 

2-4-1  رنگ آمیزی تریپان بلو ………………………………………………..

 

 

 

57

 

 

2-4-2  سنجش تترازولیوم (MTT) …………………………………………………….

 

 

 

57

 

 

2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( …………………………………………………………………..

 

 

 

58

 

 

2-4-2-2  ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم …………………………………………………

 

 

 

59

 

 

2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک …………………….

 

 

 

60

 

 

2-5  انتخاب دوز مورد نظر ………………………………………..

 

 

 

60

 

 

2-6 بررسی توان تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیم …………….

 

 

 

61

 

 

2-6-1 سنجش توانایی کلونی­زایی ………………………………

 

 

 

63

 

 

2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ………………..

 

 

 

62

 

 

2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت ……………………………………………..

 

 

 

65

 

 

2-8 آزمون­های بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ………………………………………….

 

 

 

65

 

 

2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ………………………………

 

 

 

65

 

 

2-8-2 بررسی فعالیت آنزیم­ها ………………………………………

 

 

 

66

 

 

2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری …………………………………….

 

 

 

66

 

 

2-8-2-2 ترانس آمینازها …………………………………

 

 

 

68

 

 

2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز…………………………………

 

 

 

70

 

 

2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ………………………………………………

 

 

 

72

 

 

2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک

 

 

 

72

 

 

2-8-3-1  رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ………………………..

 

 

 

73

 

 

2-8-3-2  بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده …………………………………

 

 

 

73

 

 

2-8-4  بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( …………………….

 

 

 

73

 

 

2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی …………

 

 

 

74

 

 

2-8-4-1-1 مراحل  انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( …………………………..

 

 

 

75

 

 

2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازه­گیری میزان کلسیم …..

 

 

 

76

 

 

2-8-4-2 اندازه­گیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک …………………………..

 

 

 

81

 

 

2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها …………..

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل سوم: نتایج

 

 

 

82

 

 

3-1 الف: نتایج مرحله اول …………………………………

 

 

 

82

 

 

3-1-1  رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم ……………………

 

 

 

82

 

 

3-1-2  اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت ……………………

 

 

 

85

 

 

3-1-3  بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ………………

 

 

 

87

 

 

3-1-4  نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول ……………………………………………..

 

 

 

89

 

 

3-1-5  اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ……

 

 

 

91

 

 

3-1-6  میزان الکترولیتها…………………………………………..

 

 

 

92

 

 

3-2  نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست …………………………..

 

 

 

92

 

 

3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ………………………..

 

 

 

93

 

 

3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ­آمیزی فلورسنت در نمونه­های  استئوژنیک

 

 

 

96

 

 

3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ………………………………..

 

 

 

97

 

 

3-2-3-1  میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ………………………………………………..

 

 

 

100

 

 

3-2-3-2  میزان رسوب کلسیم ……………………………………..

 

 

 

101

 

 

3-2-3-3  بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز ………….

 

 

 

101

 

 

3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ………………………………………………………..

 

 

 

103

 

 

3-2-3-5  بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ………………..

 

 

 

103

 

 

3-2-3-6  بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک ……………………………………………

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری

 

 

 

105

 

 

4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ………………………..

 

 

 

105

 

 

4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها ……………………………………………………

 

 

 

108

 

 

4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی …………………………………………………………………

 

 

 

109

 

 

4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی ….

 

 

 

113

 

 

4-1-4  اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ………………………………………

 

 

 

116

 

 

4-2  اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ………………………………

 

 

 

116

 

 

4-2-1 توانایی زیستی …………………………………….

 

 

 

119

 

 

4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها …………………………………………….

 

 

 

120

 

 

4-2-3  بررسی فاکتورهای استئوژنیک …………………….

 

 

 

124

 

 

4-2-4  بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی …………..

 

 

 

127

 

 

4-2-5  تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی ……………………………………………..

 

 

 

128

 

 

4-3  نتیجه گیری ………………………………………………………

 

 

 

129

 

 

4-4 پیشنهادات …………………………………………………………….

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فصل پنجم:ضمیمه

 

 

 

131

 

 

5-1 روش تهیه محیط کشت ………………………………………………….

 

 

 

131

 

 

5-2  تهیه ی فسفات بافر سالین PBS^– …………………………….

 

 

 

132

 

 

5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS⁺………………………

 

 

 

132

 

 

5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک …………………………..

 

 

 

133

 

 

5-5  آماده سازی آلیزارین رد ……………………………………………

 

 

 

133

 

 

5-6  روش تهیه محلول تریپان­بلو 4/0 درصد …………………………….

 

 

 

133

 

 

5-7  تهیه کریستال ویولت ………………………………………

 

 

 

133

 

 

5-8 روش تهیه محلول   MTT………………………………….

 

 

 

133

 

 

5-9  روش تهیه بافر شست و شو(  ( Tris-Hcl-NaCl…………………..

 

 

 

133

 

 

5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر  استخراج ( Tris-Hcl) …………

 

 

 

134

 

 

5-11 روش تهیه بافر ARS ……………….

 

 

 

134

 

 

5-12 روش تهیه محلول BSA ……………………………

 

 

 

134

 

 

5-13   روش تهیه محلول کمپلکس لاوری …………

 

 

 

135

 

 

5-14  روش تهیه بافر استخراج کلسیم ………………………….

 

 

 

135

 

 

5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ ….

 

 

تعریف سلول­های بنیادی

 

   به طور نرمال سلول­های تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی می­مانند، اما در بدن سلول­های دیگری به نام سلول­های بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلول­های دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا می­باشند (1).

 

سلول­های بنیادی[1] سلول­هایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلول­های تخصص­یافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلول­ها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلول­هایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلول­های تمایزیافته می‌باشند (شکل 1-1)(1).

 

به دلیل این­که این سلول­ها منشا تولید بقیه انواع سلول­ها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار می­رود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلول­های تخصص یافته را دارد. این سلول­ها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادی تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی می­ماند. سلول­های بنیادی در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاری از سلول­ها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته می­شوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت برای جایگزینی دیگر سلول­ها را دارا می­باشند. وقتی یک سلول بنیادی تقسیم می­شود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادی باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلول­های خونی و … تمایز یابد (1).

 

 

 

 

 

شکل1-1: توانائی خودنوزائی و  پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com)

 

 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی

 

   تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلول­ها در تولید نسخه­های یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلول­های دختری عینا شبیه سلول­های مادری باقی می­ماند.

 

خودتجدیدی سلول­ها بنیادی تحت تاثیر سیگنال­های درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنال­های درونی، خودتجدیدی سلول­های بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز می­باشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلول­های بنیادی باقی می­مانند یا متمایز می­شوند (2).

 

1-1-3 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس توان تمایزی آن­ها:

 

   سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:

 

الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلول­ها می­توان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلول­های بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلول‌ها می‌توانند به انواع سلول‌های جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.

 

ب) پر توان[5]: این نوع سلول­ها قادر به ساخت غالب یا همه سلول­های فرد هستند. به عنوان مثال سلول­های بنیادی جنینی تحت شرایط خاص می­توانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلول­های جفت نیستند. سلول‌های بنیادی جنینی و سلول‌های پر توان القایی جز این دسته از سلول‌های بنیادی می‌باشند.

 

پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول‌ تمایز پیدا می­‌کنند (در بافت­های بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).

 

ت) یک توان[7]: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کرده­اند. مانند سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).

 

 

 

شکل 1-2: دسته­بندی سلول­های بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).

 

1-1-4 دسته­بندی سلول­های بنیادی بر اساس منشا

 

   سلول­های بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیم­بندی می­شوند

 

1-1-4-1 سلول­های بنیادی جنینی

 

  کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلول­های بنیادی جنینی انسانی (ESCs) [8] در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.

 

سلول­های بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (ICM)[9]جنین در مرحله بلاستوسیت به دست می­آیند. بلاستوسیت مرحله­ای از تکوین پیش از لانه­گزینی در پستانداران است که معمولا چهار تا پنج روز بعد از لقاح ایجاد می­شود. در این مرحله جنین 200-100 سلول دارد و به صورت کره­ای توخالی است. این کره متشکل از یک لایه سلولی برونی (تروفواکتودرم) است که به طور معمول پس از لانه­گزینی در رحم، بخشی از جفت را می­سازد. همچنین این کره مجتمعی از سلول­ها (حدود 30-20سلول) در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است که قادرند لایه­های مختلف جنین کامل را تولید کنند (شکل 1-3) (4).