1-9 درمان ریفلاکس وزیکویورترال. 16

 

1-9-1 پیشگیری آنتی بیوتیکی. 16

 

1-9-2 جراحی باز 17

 

1-9-3 تزریق آندوسکوپی. 17

 

1-10   VURفامیلی. 18

 

1-11 شناسایی یک ژن یا لوکوس ویژه مرتبط با VUR. 19

 

1-11-1  uroplakin. 20

 

1-11-2 SLIT2/ROBO2. 20

 

1-11-3 Transforming growth factor-β1. 20

 

1-12 اصول کلی واکنش زنجیره ای پلیمراز 25

 

1-12-1 مواد مورد نیاز برای واکنش PCR. 26

 

1-13 آنالیز PCR-RFLP. 27

 

1-14روش های آنالیز برای مطالعات وابستگی SNP. 28

 

1-15 اهمیت موضوع. 29

 

1-16 فرضیه های مطالعه 31

 

1-17 هدف از مطالعه 31

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1 بررسی ارتباط پلی مورفیسم ژن TGF-β1 با VUR فامیلی. 34

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1 نوع مطالعه 37

 

3-2 جامعه مورد مطالعه 38

 

3-2-1 گروه بیمار 38

 

3-2-2 گروه سالم 38

 

3-3 نمونه‌گیری. 38

 

3-4 متغیرهای تحقیق. 38

 

3-5 استخراج DNA. 39

 

3-6  اندازه گیری کیفیت و غلظت DNA. 40

 

3-7 دستورالعمل PCR برای نشانگر PCR-RFLP. 41

 

3-7-1 طراحی پرایمرها اختصاصی برای تعیین SNP. 41

 

3-7-2  dNTPs 41

 

) 42

 

3-7-4 بافر واکنش PCR. 42

 

3-7-5 آنزیم Taq Polymerase. 42

 

3-7-6  آب دوبار تقطیر شده استریل. 42

 

3-8 راه اندازی واکنش PCR. 42

 

3-9 برنامه دمایی PCR. 43

 

3-10  الکتروفورز ژل آگارز 43

 

3-10-1مواد لازم الکتروفورز ژل آگاروز2%.. 43

 

3-10-2 طرز تهیه ژل آگارز 2%.. 43

 

3-10-3طرز تهیه بافر TBE 1X. 44

 

3-10-4طرز تهیه اتیدیوم‌برماید 44

 

3-11 هضم آنزیمی. 44

 

3-12 روش تجزیه و تحلیل داده ها : 45

 

3-13بررسی تعادل هاردی-واینبرگ. 46

 

3-14 آزمون كای دو )رابطه بین دو متغیر كیفی) 47

 

3-15 روش آماری. 47

 

3-16 آزمون استقلال کای اسکوئر 47

 

3-17آزمون نیکویی برازش کای اسکوئر 47

 

3- 18 انحراف معیار از میانگین (SE, SEM) 48

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 نتایج هضم آنزیمی. 50

 

4-2مقایسه ی توزیع فراوانی پلی مورفیسم ژن TGFB1 در كودكان مبتلا به ریفلاكس وزیكویورترال با كودكان سالم 51

 

4-3نحوه آنالیز ژنوتیپ های CC،TC و TT. 52

 

 

4-3-1 آنالیز ژنوتیپ های CC،TC وTT در دو گروه بیماران مبتلا به ریفلاكس وزیكویورترال و گروه كنترل زمانیكه ژنوتایپ CCبه عنوان مرجع (رفرنت ) باشد. 52

 

4-3-2  آنالیز ژنوتیپ های CC،TC و TT در دو گروه بیماران مبتلا به ریفلاكس وزیكویورترال و گروه كنترل زمانیكه ژنوتایپ TT به عنوان مرجع (رفرنت ) باشد. 54

 

4-4 آنالیز آلل های T و C در دو گروه كودكان مبتلا به ریفلاكس وزیكویورترال و كودكان سالم (گروه كنترل) 55

 

4-5 بررسی تعادل هاردی واینبرگ در گروه كودكان مبتلا به ریفلاكس وزیكویورترال. 57

 

4-6 بررسی تعادل هاردی واینبرگ در گروه كودكان سالم (كنترل) 58

 

4-7 انحراف معیار از میانگین. 59

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1 پیشنهادات: 65

 

66

 

عنوان                                                     فهرست اشکال                                                    شماره صفح

 

شکل1-1 سیستم درجه بندی مطالعه جهانی ریفلاکس……………………………………………………………………………………………..3

 

شکل2-1 اتصال یوترووزیکال………………………………………………………………………………………………………………………………………..4

 

شکل3-1 نمایی از کانال حالب درون دیواره مثانه……………………………………………………………………………………………………….7

 

شکل4-1 مثال های کلینیکی از مطالعه ریفلاکس………………………………………………………………………………………………………9

 

شکل5-1 VCUG در کودک 4 ساله نشان دهده برگشت دو طرفه ادرار ……………………………………………………………….12

 

شکل6-1 نقشه ژن TGF-beta1 انسانی……………………………………………………………………………………………………………………23

 

شکل7-1 تصویر شماتیک نحوه انجام PCR  ……………………………………………………………………………………………………………26

 

شکل8-1 روش های آنالیز برای مطالعات وابستگی SNP ……………………………………………………………………………………….29

 

شکل1-3 تصویر مربوط به بررسی نتیجه استخراج DNA روی ژل آگارز………………………………………………………………..40

 

شکل1-4 قطعه حاصل از تکثیر  پی سی آر (808 جفت باز)…………………………………………………………………………………..50

 

شکل2-4 سه ژنوتیپ حاصل از هضم آنزیم……………………………………………………………………………………………………………….50

 

عنوان                                                        فهرست جداول                                                  شماره صفحه

 

جدول1-1 ژنها و مکان های ژنی بالقوه دخیل در  تکامل کلیه و یا مثانه …………………………………………………………………..24

 

جدول 1-3 مربوط به متغیرهای تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………….39

 

جدول 2-3 پرایمرها اختصاصی…………………………………………………………………………………………………………………………………..41

 

جدول 3-3 مواد و مقادیر لازم برای واکنش هضم آنزیمی یک نمونه………………………………………………………………………..45

 

جدول 4-3 محاسبه مرحله به مرحله ژنوتیپ های مورد انتظار………………………………………………………………………………..46

 

جدول 1-4 فراوانی ژنوتیپ های CC،TC و TT…………………………………………………………………………………………………….51

 

جدول 2-4 فراوانی ژنوتایپ های CC،TC و   TT…………………………………………………………………………………………………53

 

جدول 3-4 آزمون کای اسکوئر در دو گروه كودكان مبتلا به ریفلاكس و كودكان سالم………………………………………….53

 

جدول 4-4 تخمین ریسک برای هنگامی که cc رفرنت فرض شده………………………………………………………………………….53

 

جدول5-4 فراوانی ژنوتایپ های CC،TC و   TT …………………………………………………………………………………………………..54

 

جدول6-4 آزمون کای اسکوئر ژنوتیپ TT رفرنت در نظر گرفته می شود………………………………………………………………54

 

جدول 7-4 تخمین ریسک برای هنگامی که TT رفرنت فرض شده………………………………………………………………………..55

 

جدول8-4 فراوانی آلل های T و C…………………………………………………………………………………………………………………………….55

 

جدول9-4آزمون کای اسکوئر برای بررسی آلل های Tو C……………………………………………………………………………………….56

 

1-3-4) پارادیدیم. 7

 

1-3-5) طناب اسپرماتیک.. 7

 

1-3-6) اسکروتوم یا کیسه بیضه 7

 

1-3-6-1) عصب گیری. 8

 

1-3-7) سمینال وزیکولها 8

 

1-3-7-1) ساختمان سمینال وزیکول. 9

 

1-3-7-2) عصب گیری. 9

 

1-3-8) مجرای انزالی. 9

 

1-3-8-1) ساختمان. 9

 

1-3-9) پروستات.. 9

 

1-3-9-1) ساختمان پروستات.. 10

 

1-3-9-2) لوب های پروستات.. 10

 

1-3-9-3) عصب گیری. 10

 

1-3-10)غدد بولبواورترال. 10

 

1-3-10-1) ساختمان. 11

 

1-4) سلول های سری اسپرماتوژنز 11

 

1-5) سلولهای پشتیبان یا سرتولی. 11

 

1-6) اسپرماتوژنز 12

 

1-6-1) اسپرماتوسیتوژنز 12

 

1-6-2) میوز 12

 

1-6-3) اسپرمیوژنز 13

 

1-7) مورفولوژی اسپرم 13

 

1-7-1) سر اسپرم 13

 

1-7-2) دم اسپرم 14

 

تصویر 1-1. ساختمان طبیعی اسپرم انسان (Parsiteb, 2013) 14

 

1-7-3) اسپرم های غیر طبیعی. 14

 

تصویر 2-1 انواع شکل های اسپرم(blogfa, 2013) 15

 

1-8) سرنوشت و اعمال آندروژن ها 15

 

1-8-1) آندروژن های داخل بیضه ای. 15

 

1-8-2) تبدیل محیطی استروژن. 15

 

1-8-3)تبدیل محیطی دی هیدروتستوسترون. 16

 

1-8-4) اعمال محیطی تستوسترون. 16

 

1-8-5) مکانیسم عمل آندروژن. 16

 

1-8-6) انتقال و متابولیسم آندروژن ها 17

 

1-8-7) محور  هیپوتالاموس- هیپوفیز- بیضه 17

 

تصویر1-3: محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزی- بیضه ای (Bern et al, 2010) 17

 

1-9) بلئومایسین. 18

 

1-9-1)  تاریخچه و ساختمان شیمیایی بلئومایسین. 18

 

تصویر 1-4: ساختمان شیمیایی بلئومایسین(Umenzawa et al, 1966 ). 18

 

1-9-2) مکانیسم  اثر بلئومایسین: 19

 

تصویر 1-5: مکانسم عمل بلئومایسین(Nature, 2013) 19

 

1-9-3) کاربردهای بالینی. 20

 

1-10) استرس اکسیداتیو. 21

 

1-10-1) گونه های فعال اکسیژن(ROS): 21

 

1-10-2) پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر: 21

 

تصویر 1-6: پیامدهای استرس اکسیداتیو در دستگاه تولید مثلی نر(Clevelandclinic, 2013) 22

 

1-11) آنتی اکسیدانت ها و نقش حفاظتی آنها در برابر استرس اکسیداتیو: 23

 

1-12) سنجش استرس اکسیداتیو. 25

 

1-12-1) مالون دی آلدئید (MDA) 25

 

1-12-2) گلوتاتیون احیا (GSH) 25

 

1-12-3) آنزیم کاتالاز 26

 

1-13) ژل رویال. 26

 

1-13-2) طریقه نگهداری. 26

 

 

1-13-3) خواص فیزیکی ژل رویال. 27

 

1-13-4) خواص درمانی ژل رویال. 28

 

1-13-4-1) خاصیت میکروب کشی. 28

 

1-13-4-2) کاهش فشار خون. 28

 

1-13-4-3) جلوگیری از تصلب شرائین. 28

 

1-13-4-4) جوانی و شادابی پوست و ضد پیری. 29

 

1-13-4-5) خاصیت ضد سرطانی. 29

 

1-14) تولیدمثل در موشهای صحرایی : 29

 

1-14-1) بلوغ : 29

 

1-14-2) رفتار تولیدمثلی : 30

 

1-14-3) دستگاه تولیدمثلی موشهای صحرایی نر : 30

 

تصویر 1-7: دستگاه تولیدمثلی موشهای صحرایی نر(Russell, 1992). 32

 

1-15) تولید جنین در شرایطIn Vivo. 32

 

1-15-1) آمیختن گامت ها 32

 

1-16) تولید جنین در شرایط آزمایشگاهی. 33

 

1-16-1) ظرفیت پذیری اسپرم 33

 

1-16-2) لقاح آزمایشگاهی (IVF) 34

 

2-1) مواد و تجهیزات مورد نیاز 35

 

2-2) حیوانات مورد مطالعه: 35

 

2-2-1) تعیین دوز مؤثر دارو و حیوانات.. 35

 

2-2-2) گروه بندی حیوانات: 36

 

2-3) نمونه برداری. 36

 

2-4) مراحل تهیه مقاطع بافتی. 37

 

2-4-1)  آبگیری (dehydration) 37

 

2-4-2) شفاف سازی (clearing) 37

 

2-4-3) نفوذ و آغشتگی. 37

 

تصودر 2-1: مراحل قالب گیری بافت(Istockphoto, 2013) 38

 

2-4-5) برش بافت و ثابت کردن مقاطع بافتی بر روی لام 38

 

2-4-6) رنگ آمیزی مقاطع بافتی. 38

 

2-4-6-1) رنگ آمیزی آهن وایگرت.. 39

 

2-5)  آماده سازی موش برای IVF.. 41

 

2-5-1) آماده سازی محیط کشت برای IVF.. 41

 

2-5-2) طرز تهیه محیط کشت  mR1ECM: 41

 

2-5-3) آماده سازی اسپرم : 42

 

2-5-4) روش گرفتن تخمک بالغ و لقاح داخل آزمایشگاهی(IVF): 42

 

2-5-4-1) لقاح داخل آزمایشگاهی (IVF): 42

 

2-5-4-2) ارزیابی رشد جنین ها: 42

 

تصویر2-2: مراحل انجام پروسه IVF.. 43

 

. 2-6) ارزیابی هیستومورفومتریک بیضه 44

 

2-7) ارزیابی فاکتور های مختلف بافت بیضه 44

 

2-7-1)  ضریب تمایز لوله ای (TDI) 44

 

2-7-2) ضریب اسپرمیوژنز (SPI) 44

 

2-7-3) ضریب سلول سرتولی (SCI) 44

 

2-7-4) ضریب میوزی (MI) 44

 

2-8) ارزیابی خصوصیات اسپرم ها 45

 

2-8-1)  نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم 45

 

2-8-2) شمارش اسپرمها : 45

 

2-8-3) ارزیابی قابلیت زنده ماندن اسپرم ها 45

 

2-8-4) بررسی تحرک اسپرماتوزوئیدها 45

 

2-8-5) بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB) 46

 

2-8-6)  بررسی DNA شکسته و یا تک رشته ای: رنگ آمیزی آکریدین اورانژ (AO) 46

 

2-9) سنجش فاکتورهای بیوشیمیایی. 46

 

2-9-1)  روش اندازه گیری مالون دی آلدئید : 46

 

2-9-2) روش اندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی کل(FRAP): 47

 

2-9-3) روش اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز: 48

 

2-10) اندازه گیری تستوسترون سرمی. 48

 

2-11) مطالعات هیستوشیمیایی بیضه 48

 

2-11-1) رنگ آمیزی آهن وایگرت.. 48

 

2-11) آنالیز و تحلیل داده ها 48

 

3-1) نتایج حاصل از ارزیابی خصوصیات اسپرم 50

 

3-1-1) نتایج حاصل از بررسی تعداد اسپرم 50

 

نمودار 3-1: مقایسه میانگین تعداد اسپرم ها در گروه های تحت تیمار(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل و گروه ژل رویال ( p<0.05)؛ # اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p<0.05)) 51

 

3-1-2) نتایج حاصل از مطالعه میزان اسپرم زنده 51

 

تصویر 3-1: اسپرم زنده(1) با سر بدون رنگ و  اسپرم مرده با سر صورتی(2)، رنگ آمیزی ائورین(E&N ×400). 52

 

نمودار3-2 درصد اسپرم های زنده در گروه های تحت تیمار(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل و  گروه ژل رویال ( p<0.05)، # اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p<0.05)) 52

 

3-1-3)نتایج حاصل از مطالعه میزان تحرک اسپرم 53

 

3-1-4) نتایج بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم 54

 

3-1-5) نتایج حاصل از مطالعه DNA اسپرم 56

 

3-2) یافته های بیوشیمیایی. 58

 

3-2-1) نتایج حاصل از بررسی میزان مالون دی آلدئید. 58

 

3-2-2) نتایج حاصل از اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی کل. 59

 

3-2-3) نتایج حاصل از اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز 60

 

3-2-4) نتایج حاصل از بررسی سطح تستوسترون. 61

 

3-3) نتایج بررسی های بافت شناسی بافت بیضه 63

 

3-3-1) یافته های مورفولوژیک در بافت بیضه 63

 

3-3-2) یافته های هیستومورفومتریک در بافت بیضه 66

 

3-3-2-1) نتایج حاصل از اندازه گیری قطر لوله های سمینیفر 66

 

3-3-3) نتایج حاصل از ارزیابی های اسپرماتوژنز  در بافت بیضه 67

 

3-3-3-1) نتایج حاصل از محاسبه ضریب اسپرمیوژنز 67

 

3-3-3-2) نتایج حاصل از ضریب سلول های سرتولی. 68

 

3-3-3-3) نتایج حاصل از محاسبه ضریب تمایز لوله ای. 69

 

3-3-3-4) نتایج حاصل ازاندازه گیری ضریب میوزی. 70

 

3-4)  نتایج حاصل از مطالعه پارامترهای مختلف لقاح (IVF) 72

 

3-4-1) نتایج حاصل از تعداد اووسیت های لقاح یافته در گروه های تحت تیمار 72

 

3-4-2) نتایج حاصل از تعداد جنین های دو سلولی. 73

 

3-4-3) نتایج حاصل از تعداد بلاستوسیست.. 74

 

3-4-4) نتایج حاصل از تعداد جنین های متوقف شده 75

 

4-1) تاثیر بلئومایسین و  ژل رویال بر فاکتورهای بیوشیمیایی. 80

 

4-2) تاثیر بلئومایسین و ژل رویال بر میزان تحرک اسپرم: 81

 

4-3) تاثیر بلئومایسین و ژل رویال بر میزان ترشح تستوسترون. 81

 

4-4) بررسی تاثیر بلئومایسین و ژل رویال بر بلوغ اسپرم 82

 

4-5) بررسی تاثیر بلئومایسین و ژل رویال بر کیفیت DNA  اسپرم 82

 

 

 

مقدمه

 

 

1-1

 

 

 

4

 

 

فصل دوم: کلیات

 

 

2

 

 

 

5

 

 

سلول بنیادی و تاریخچه

 

 

2-1

 

 

 

6

 

 

تعریف کلی سلول بنیادی

 

 

2-2

 

 

 

6

 

 

تقسیم بندی سلول­های بنیادی

 

 

2-3

 

 

 

6

 

 

تقسیم بندی بر اساس قدرت تمایزی

 

 

2-3-1

 

 

 

7

 

 

تقسیم بندی بر اساس منشاء

 

 

2-3-2

 

 

 

8

 

 

تمایز سلول­های بنیادی

 

 

2-4

 

 

 

8

 

 

منابع سلول­های بنیادی

 

 

2-5

 

 

 

10

 

 

شاخص­های سطحی سلول­های بنیادی

 

 

2-6

 

 

 

10

 

 

سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

 

2-7

 

 

 

10

 

 

مقدمه

 

 

2-7-1

 

 

 

11

 

 

آنتی ژن­های فنوتیپیک و ویژگی سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-2

 

 

 

11

 

 

منبع سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-3

 

 

 

12

 

 

جداسازی سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-4

 

 

 

12

 

 

مکانیسمهای انعطاف پذیری سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-5

 

 

 

13

 

 

خود­نوزائی یا خود­تجدیدی سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-6

 

 

 

13

 

 

تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-7

 

 

 

14

 

 

محرک­های آزمایشگاهی تاثیر گذار بر تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-8

 

 

 

14

 

 

مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-7-9

 

 

 

14

 

 

تاثیر سلول بنیادی مزانشیمی بر روی سیستم ایمنی

 

 

2-7-10

 

 

 

15

 

 

تاثیر سلول­های بنیادی مزانشیمی بروی لنفوسیت­هایT

 

 

2-7-10-1

 

 

 

15

 

 

تاثیر سلول­های بنیادی مزانشیمی برسلول­هایT تنظیمی

 

 

2-7-10-2

 

 

 

15

 

 

تاثیر سلول­های بنیادی مزانشیمی بر لنفوسیت          B

 

 

2-7-10-3

 

 

 

16

 

 

تاثیر سلول­های بنیادی مزانشیمی برسلول­های عرضه كننده آنتی ژن

 

 

2-7-10-4

 

 

 

16

 

 

حفاظت عصبی سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-8

 

 

 

17

 

 

فاکتورهای سرکوب سیستم ایمنی سلول­های مزانشیمی

 

 

2-9

 

 

 

19

 

 

نحوه کاربرد سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-10

 

 

 

19

 

 

استفاده درمانی از سلول­های بنیادی مزانشیمی

 

 

2-11

 

 

 

20

 

 

سیستم ایمنی

 

 

2-12

 

 

 

20

 

 

اجزای سیستم ایمنی

 

 

2-12-1

 

 

 

21

 

 

التهاب

 

 

2-12-2

 

 

 

21

 

 

نوتروفیل

 

 

2-12-3

 

 

 

22

 

 

گرانول­های نوتروفیل

 

 

2-12-4

 

 

 

22

 

 

فاگوسیتوز

 

 

2-12-5

 

 

 

24

 

 

انفجار تنفسی

 

 

2-12-6

 

 

 

25

 

 

آنزیم­های تجزیه کننده

 

 

2-12-7

 

 

 

25

 

 

فعال شدن نوتروفیل

 

 

2-12-8

 

 

 

25

 

 

پذیرنده­های سطحی نوتروفیل

 

 

2-12-9

 

 

 

26

 

 

سرنوشت نوتروفیل­ها

 

 

2-12-10

 

 

 

26

 

 

انواع مرگ سلولی

 

 

2-13

 

 

 

26

 

 

آپوپتوز

 

 

2-13-1

 

 

 

27

 

 

مسیرهای آپوپتوزی

 

 

2-13-2

 

 

 

29

 

 

ویتامین

 

 

2-14

 

 

 

29

 

 

انواع ویتامین

 

 

2-14-1

 

 

 

30

 

 

ویتامین D

 

 

2-14-2

 

 

 

32

 

 

فصل سوم: مواد و روش کار

 

 

3

 

 

 

33

 

 

طرز تهیه محیط کشت DMEM

 

 

3-1

 

 

 

34

 

 

طرز تهیه محیط کشت RPMI

 

 

3-2

 

 

 

35

 

 

تعیین زنده­مانی و شمارش سلول به روش تریپان بلو

 

 

3-3

 

 

 

36

 

 

جدا سازی وکشت سلول بنیادی مزانشیمال مغز استخوان رت

 

 

3-4

 

 

 

38

 

 

تریپسینه کردن وپاساژ دادن سلول­ها

 

 

3-5

 

 

 

39

 

 

جداسازی نوتروفیل

 

 

3-6

 

 

 

41

 

 

تیمار سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت با ویتامین D3

 

 

3-7

 

 

 

41

 

 

مجاور­سازی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 و مایع رویی آنها با نوتروفیل های جدا شده از خون محیطی رت

 

 

3-8

 

 

 

41

 

 

مجاورسازی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت تیمار شده با ویتامین D3 با سلول­های نوتروفیل

 

 

3-8-1

 

 

 

41

 

 

مجاور سازی مایع­رویی سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان تیمار شده با ویتامین D3 با سلول­های نوتروفیل

 

 

3-8-2

 

 

 

42

 

 

فاگوسیتوز مخمر

 

 

3-9

 

 

 

42

 

 

آماده سازی سوسپانسیون مخمر

 

 

3-9-1

 

 

 

43

 

 

روش انجام فاگوسیتوز

 

 

3-9-2

 

 

 

45

 

 

سنجش انفجار تنفسی توسط احیاء نیتروبلوتترازولیوم (NBT)

 

 

3-10

 

 

 

46

 

 

سنجش زنده­مانی سلول نوتروفیل در مواجه با سلول­های بنیادی مزانشیمی و مایع رویی آن

 

 

3-11

 

 

 

47

 

 

آنالیز آماری

 

 

3-12

 

 

 

48

 

 

فصل چهارم: نتایج

 

 

4

 

 

 

49

 

 

نتایج مجاورسازی سلول مزانشیمی تیمار شده و سلول نوتروفیل                       

 

 

4-1

 

 

 

49

 

 

ارزیابی قابلیت انفجار تنفسی(NBT)                                            

 

 

4-1-1

 

 

 

49

 

 

ارزیابی فاگوسیتوز                                                                  

 

 

4-1-2

 

 

 

50

 

 

ارزیابی آپوپتوز

 

 

4-1-3

 

 

 

51

 

 

نتایج مجاورسازی مایع رویی سلول مزانشیمی تیمار شده  و  سلول نوتروفیل

 

 

4-2

 

 

 

51

 

 

ارزیابی قابلیت انفجار تنفسی(NBT)

 

 

4-2-1

 

 

 

52

 

 

ارزیابی فاگوسیتوز

 

 

4-2-2

 

 

 

53

 

 

ارزیابی آپوپتوز

 

 

4-2-3

 

 

 

56

 

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

 

5

 

 

 

57

 

 

بحث

 

 

5-1

 

 

 

60

 

 

پیشنهادات

 

 

5-2

 

 

 

61

 

 

فصل ششم: منابع

 

 

6

 

 

 

62

 

 

منابع

 

 

6-1

 

 

 

73

 

 

چکیده انگلیسی

 

 

 

 

 

فهرست نمودارها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

صفحه	عنوان	ردیف
49	ارزیابی قابلیت انفجار تنفسی سلول­های نوتروفیل مجاور شده با سلول­های مزانشیمی تیمار شده با غلظت­های متفاوت ویتامین D3 در زمان­های مختلف	4-1
50	ارزیابی قابلیت فاگوسیتوز سلول­های نوتروفیل مجاور شده با سلول­های مزانشیمال تیمار شده با غلظت­های متفاوت ویتامین D3 در زمان­های مختلف	4-2
51	ارزیابی میزان آپوپتوز سلول­های نوتروفیل مجاور شده با سلول­های مزانشیمال تیمار شده با غلظت­های متفاوت ویتامین D3 در زمان­های مختلف	4-3
52	ارزیابی میزان انفجار تنفسی سلول­های نوتروفیل مجاور شده با مایع­رویی سلول­های مزانشیمی تیمار شده با غلظت­های متفاوت ویتامین D3 در زمان­های مختلف	4-4
52	ارزیابی میزان فاگوسیتوز سلول­های نوتروفیل مجاور شده با مایع­رویی سلول­های مزانشیمی تیمار شده با غلظت­های متفاوت ویتامین D3 در زمان­های مختلف	4-5
53	ارزیابی میزان آپوپتوز سلول­های نوتروفیل مجاور شده با مایع­رویی سلول­های مزانشیمی تیمار شده با غلظت­های متفاوت ویتامین D3 در زمان­های مختلف	4-6

 

فهرست تصاویر

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-4 تنش­های گیاهی……………………………………………………………………………………………………. 7

 

 

• تعریف تنش…………………………………………………………………………………………………… 8

 

1-4-1-1 تنش آب……………………………………………………………………………………………………… 8

 

1-5 تاثیر تنش خشکی بر میزان جذب پتاسیم در گیاه………………………………………………………………… 11

 

1-6 اثرات فیزیولوژیکی تنش خشکی در گیاهان……………………………………………………………………….. 11

 

1-7 پاسخ روزنه به تنش خشکی……………………………………………………………………………………….. 12

 

1-7-1 نقش پتاسیم در پاسخ روزنه……………………………………………………………………………………. 13

 

1-8 اثرات تنش خشکی بر فتوسنتز…………………………………………………………………………………….. 13

 

1-8-1 نقش پتاسیم در فتوسنتز……………………………………………………………………………………….. 13

 

1-9 روش­های مقابله گیاه با تنش………………………………………………………………………………………. 13

 

1-10 کلروفیل­ها………………………………………………………………………………………………………… 14

 

1-10-1 طیف جذبی کلروفیل­ها……………………………………………………………………………………….. 14

 

1-11 کاروتنوئیدها……………………………………………………………………………………………………… 15

 

1-12 ترکیبات فنلی ……………………………………………………………………………………………………. 16

 

1-13 پرولین……………………………………………………………………………………………………………. 17

 

1-14 مرور منابع………………………………………………………………………………………………………… 18

 

1-14-1 تاثیر تنش خشکی بر محتوای پرولین…………………………………………………………………………. 18

 

1-14-2 تاثیر تنش خشکی بر محتوای پروتئین……………………………………………………………………….. 19

 

1-14-3 تاثیر تنش خشکی بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی…………………………………………………………. 19

 

1-14-4 بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای MDA…………………………………………………………………… 20

 

1-14-5 بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای فنول تام…………………………………………………………………. 20

 

 

 

1-14-6 بررسی اثر تنش خشکی بر محتوای پتاسیم برگ…………………………………………………………….. 21

 

1-14-7 نحوه عملکرد نانو مواد در تنش خشکی………………………………………………………………………. 21

 

1-15 اهداف پژوهش……………………………………………………………………………………………………. 23

 

فصل دوم

 

2- مواد و روش­ها…………………………………………………………………………………………………… 24

 

2-1- تجهیزات و مواد شیمیایی…………………………………………………………………………………………. 25

 

2-1-1 مواد شیمیایی…………………………………………………………………………………………………… 25

 

2-1-2 تجهیزات ……………………………………………………………………………………………………….. 25

 

2-1-3 ابزار و لوازم مصرفی……………………………………………………………………………………………… 26

 

2-2 مشخصات نمونه گیاهی……………………………………………………………………………………………. 26

 

 

• آماده سازی اتاق کشت……………………………………………………………………………………………… 26

 

2-4 آبیاری………………………………………………………………………………………………………………. 27

 

2-5 آماده­سازی گلدان­ها………………………………………………………………………………………………… 27

 

2-5-1 تهیه­ی محلول هوگلند………………………………………………………………………………………….. 27

 

 

• اعمال تنش خشکی…………………………………………………………………………………………………. 30

 

• تیماردهی…………………………………………………………………………………………………………… 30

 

• نمونه­برداری………………………………………………………………………………………………………… 30

 

2-9 سنجش پرولین…………………………………………………………………………………………………….. 30

 

2-10 سنجش پروتئین کل  به روش برادفورد………………………………………………………………………….. 31

 

2-10-1 تهیة معرف برادفورد…………………………………………………………………………………………… 31

 

2-10-2 ترسیم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………………. 32

 

2-11 سنجش كلروفیل و كاروتنوئید ………………………………………………………………………………….. 32

 

2-12 اندازه­گیری مالون دی آلدهید……………………………………………………………………………………. 33

 

2-13 استخراج آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی………………………………………………………………………….. 33

 

2-13-1 سنجش آنتی اکسیدان­های غیرآنزیمی……………………………………………………………………….. 34

 

2-13-1-1 سنجش فنل تام……………………………………………………………………………………………. 34

 

2-13-1-2 رسم منحنی استاندارد گالیک اسید……………………………………………………………………….. 34

 

2-14 اندازه گیری پتاسیم به روش نشر شعله (AES)………………………………………………………………… 35

 

2-14-1 تهیه عصاره گیاه به روش سوزاندن خشک  و ترکیب باHCL ………………………………………………. 35

 

 

2-14-2 تهیه محلول ها………………………………………………………………………………………………… 36

 

2-14-3 روش کار………………………………………………………………………………………………………. 36

 

2-15 تجزیه آماری……………………………………………………………………………………………………… 37

 

فصل سوم

 

3- نتایج…………………………………………………………………………………………………………………. 38

 

3-1 اندازه­گیری مقادیر پرولین………………………………………………………………………………………….. 39

 

3-1-1 نتایج حاصل از سنجش پرولین در چین اول…………………………………………………………………… 39

 

3-1-2 نتایج حاصل از سنجش پرولین در چین دوم…………………………………………………………………… 40

 

3-1-3 نتایج حاصل از سنجش پرولین در چین سوم………………………………………………………………….. 40

 

3-2 اندازه­گیری مقادیر پروتئین………………………………………………………………………………………… 42

 

3-2-1 نتایج حاصل از سنجش پروتئین در چین اول………………………………………………………………….. 42

 

3-2-2 نتایج حاصل از سنجش پروتئین در چین دوم………………………………………………………………….. 43

 

3-2-3 نتایج حاصل از سنجش پروتئین در چین سوم…………………………………………………………………. 44

 

3-3 رنگیزه­های فتوسنتزی……………………………………………………………………………………………… 46

 

3-3-1 کلروفیل a………………………………………………………………………………………………………. 46

 

3-3-1-1 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل a در چین اول……………………………………………………………. 46

 

3-3-1-2 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل a در چین دوم……………………………………………………………. 47

 

3-3-1-3 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل a در چین سوم…………………………………………………………… 48

 

3-3-2 کلروفیل b………………………………………………………………………………………………………. 49

 

3-3-2-1 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل b در چین اول……………………………………………………………. 49

 

3-3-2-2 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل b در چین دوم……………………………………………………………. 50

 

3-3-2-3 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل b در چین سوم…………………………………………………………… 51

 

3-3-3 کلروفیل کل…………………………………………………………………………………………………….. 53

 

3-3-3-1 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل در چین اول………………………………………………………….. 53

 

3-3-3-2 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل در چین دوم………………………………………………………….. 53

 

3-3-3-3 نتایج حاصل از سنجش کلروفیل کل در چین سوم…………………………………………………………. 54

 

3-3-4 کاروتنوئید………………………………………………………………………………………………………. 55

 

3-3-4-1 نتایج حاصل از سنجش کاروتنوئید در چین اول……………………………………………………………. 55

 

3-3-4-2 نتایج حاصل از سنجش کاروتنوئید در چین دوم……………………………………………………………. 56

 

3-3-4-3 نتایج حاصل از سنجش کاروتنوئید در چین سوم…………………………………………………………… 57

 

3-4 اندازه­گیری پراکسیداسیون لیپیدی………………………………………………………………………………… 58

 

3-4-1 نتایج حاصل از سنجش پراکسیداسیون لیپیدی در چین اول………………………………………………….. 58

 

3-4-2 نتایج حاصل از سنجش پراکسیداسیون لیپیدی در چین دوم………………………………………………….. 59

 

3-4-3 نتایج حاصل از سنجش پراکسیداسیون لیپیدی در چین سوم…………………………………………………. 60

 

3-5 اندازه گیری غلظت فنل……………………………………………………………………………………………. 62

 

3-5-1 نتایج حاصل از اندازه­گیری فنل تام در چین اول……………………………………………………………….. 62

 

3-5-2 نتایج حاصل از اندازه­گیری فنل تام در چین دوم………………………………………………………………. 63

 

3-5-3 نتایج حاصل از اندازه­گیری فنل تام در چین سوم………………………………………………………………. 64

 

3-6 اندازه­گیری مقادیر پتاسیم برگ……………………………………………………………………………………. 65

 

3-6-1 نتایج حاصل از مقادیر پتاسیم برگ با استفاده از روش نشر شعله در چین اول……………………………….. 65

 

3-6-2 نتایج حاصل از مقادیر پتاسیم برگ با استفاده از روش نشر شعله در چین دوم……………………………….. 66

 

3-6-3 نتایج حاصل از مقادیر پتاسیم برگ با استفاده از روش نشر شعله در چین سوم………………………………. 67

 

فصل چهارم

 

4- بحث و نتیجه­گیری………………………………………………………………………………………………….. 69

 

4-1 اثرات تنش خشکی بر اندازه­گیری پرولین………………………………………………………………………….. 70

 

4-2 اثرات تنش خشکی بر اندازه­گیری پروتئین………………………………………………………………………… 71

 

4-3 اثرات تنش خشکی بر اندازه­گیری رنگیزه­های فتوسنتزی………………………………………………………….. 71

 

4-4 تاثیر تنش بر پراکسیداسیون لیپیدی………………………………………………………………………………. 72

 

4-5 تاثیر تنش بر فنول تام……………………………………………………………………………………………… 74

 

4-6 تاثیر تنش بر مقدار پتاسیم برگ…………………………………………………………………………………… 74

 

4-7 نتیجه­گیری………………………………………………………………………………………………………… 75

 

4-8 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 76

 

منابع……………………………………………………………………………………………………………………… 77

 

فهرست اشکال

 

2-1 نمایی از اتاقک کشت………………………………………………………………………………………………. 26

 

شکل 2-2 رشد گیاه در اتاق کشت……………………………………………………………………………………… 30

 

شکل 3-1 تغییرات مقادیر پرولین در چین اول…………………………………………………………………………. 39

 

شکل 3-2 تغییرات مقادیر پرولین در چین دوم………………………………………………………………………… 40

 

شکل 3-3 تغییرات مقادیر پرولین در چین سوم……………………………………………………………………….. 40

 

شکل 3-4 میانگین تغییرات مقادیر پرولین در چین اول، دوم و سوم………………………………………………….. 42

 

شکل 3-5 تغییرات مقادیر پروتئین در چین اول……………………………………………………………………….. 43

 

شکل 3-6 تغییرات مقادیر پروتئین در چین دوم……………………………………………………………………….. 44

 

شکل 3-7 تغییرات مقادیر پروتئین در چین سوم………………………………………………………………………. 45

 

شکل 3-8 میانگین تغییرات مقادیر پروتئین در چین اول، دوم و سوم…………………………………………………. 46

 

شکل 3-9 تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین اول…………………………………………………………………….. 47

 

شکل 3-10 تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین دوم…………………………………………………………………… 47

 

شکل 3-11 تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین سوم………………………………………………………………….. 48

 

شکل 3-12میانگین تغییرات مقادیر کلروفیل a در چین اول، دوم و سوم……………………………………………… 49

 

شکل 3-13 تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین اول…………………………………………………………………… 50

 

شکل 3-14 تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین دوم………………………………………………………………….. 51

 

شکل 3-15 تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین سوم………………………………………………………………….. 52

 

شکل 3-16 میانگین تغییرات مقادیر کلروفیل b در چین اول، دوم و سوم…………………………………………….. 52

 

شکل 3-17 تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین اول…………………………………………………………………. 53

 

شکل 3-18 تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین دوم…………………………………………………………………. 54

 

شکل 3-19 تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین سوم………………………………………………………………… 54

 

شکل 3-20 میانگین تغییرات مقادیر کلروفیل کل در چین اول، دوم و سوم…………………………………………… 55

 

شکل 3-21 تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین اول…………………………………………………………………… 56

 

شکل 3-22 تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین دوم…………………………………………………………………… 56

 

شکل 3-23 تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین سوم………………………………………………………………….. 57

 

شکل 3-24 میانگین تغییرات مقادیر کاروتنوئید در چین اول، دوم و سوم…………………………………………….. 58

 

شکل 3-25 تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین اول……………………………………………………………. 59

 

شکل 3-26 تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین دوم…………………………………………………………… 60

 

شکل 3-27 تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین سوم………………………………………………………….. 61

 

شکل 3-28 میانگین تغییرات مقادیر مالون دی آلدهید در چین اول، دوم و سوم…………………………………….. 62

 

شکل 3-29 تغییرات مقادیر فنل تام در چین اول………………………………………………………………………. 63

 

شکل 3-30 تغییرات مقادیر فنل تام در چین دوم………………………………………………………………………. 63

 

شکل 3-31 تغییرات مقادیر فنل تام در چین سوم……………………………………………………………………… 64

 

شکل 3-32 میانگین تغییرات مقادیر فنل تام در چین اول، دوم و سوم………………………………………………… 65

 

شکل 3-33 تغییرات مقادیر پتاسیم در چین اول………………………………………………………………………. 66

 

شکل 3-34 تغییرات مقادیر پتاسیم در چین دوم………………………………………………………………………. 66

 

• ترکیبات شیمیایی بلوط ———— 8

 

• اهمیت درمانی بلوط————— 8

 

• مصرف خوراکی بلوط———— 10

 

• اهمیت اقتصادی بلوط———— 10

 

• تنوع ژنتیکی-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 11

 

1-11-1- اهمیت تنوع ژنتیکی و روش­های مختلف ارزیابی آنبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 12

 

 

• انواع نشانگرها-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 12

 

1-12-1- نشانگرهای مورفولوژیکی– 13

 

1-12-2- نشانگرهای بیوشیمیایی— 13

 

1-12-3- نشانگرهای مولکولی مبتنی بر DNA ——— 14

 

       1-12-3-1- نشانگرهای غیر مبتنی برPCR ——- 15

 

       1-12-3-2- نشانگرهای مبتنی برPCR ———- 16

 

                1-12-3-2-1 نشانگرPAPD ———– 17

 

                1-12-3-2-2 نشانگرAFLP ———— 17

 

                1-12-3-2-3 نشانگرSSR ————- 17

 

                1-12-3-2-4 نشانگرISSR ———— 18

 

                1-12-3-2-5 نشانگرSRAP  و مزایا و معایب آنبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————- 19

 

 

• کاربرد نشانگر(مارکر)هایDNA — 20

 

• واکنش زنجیره­ای پلیمراز(PCR)—- 21

 

1-14-1- مراحل واکنش زنجیره­ای پلیمراز————- 22

 

 

• تجزیه و تحلیل داده­ها———— 24

 

1-15-1 دندروگرام————- 24

 

1-15-2 تجزیه خوشه ای——— 25

 

1-15-3 ضریب شباهت———- 26

 

1-15-4 انتخاب الگوریتم——— 26

 

 

• بررسی كارآیی الگوریتم مورد استفاده در تجزیه كلاستر—– 26

 

• شاخص شانون-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 27

 

• بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیت­ها براساس آنالیز Neiبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 27

 

• سابقه تحقیق-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 28

 

1-15-1- مروری بر برخی پژوهش­های انجام شده بر روی Quercus brantii Lindl.———— 28

 

1-15-2- مروری بر برخی پژوهش­های انجام شده با استفاده از نشانگرSRAPبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد– 28

 

فصل دوم: مواد و روش­ها

 

2-1- انتخاب مناطق و جمعیت­ها— 33

 

2-2- جمع­آوری نمونه ها و آماده سازی آنها 34

 

2-3- استخراج DNA از نمونه های گیاهی- 34
2-3-1- آماده کردن نمونه ها 34

 

 2-3-2- استخراج DNA– 35

 

 2-3-2-1- مواد موردنیاز 35

 

 2-3-2-2- روش کار- 36

 

2-4- تعیین كیفیت وكمیت DNA– 37

 

2-5- واكنش زنجیره ای پلیمراز) (PCR– 39

 

2-6- الکتروفورز- 41

 

 2-6-1- محلول اتیدیوم بروماید- 42

 

 2-6-2- تهیه ژل الکتروفورز- 43

 

 2-6-3- الکتروفورز محصول PCR– 43

 

2-7- تجزیه و تحلیل داده ها 44

 

فصل سوم: نتایج و بحث

 

3-1پلی­مورفیسم -بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——- 46

 

3-2 بررسی پارامترهای اصلی تنوع ژنتیکی همه لوکوس­ها در جمعیت­های گونهQuercus brantii Lindl.——- 50

 

3-3 بررسی تنوع و تفاوت ژنتیکی بین جمعیت­ها براساس آنالیز Nei—- 52

 

3-4 شباهت و فاصله ژنتیکی بین 5 جمعیت—– 54

 

 

3-5 بحث و نتیجه­گیری کلی—————- 55

 

3-6 پیشنهادات-بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد——– 59

 

منابع– 62

 

فهرست شکل­ها

 

شکل1- 1 پراکندگی جهانی جنس بلوط (Quercus)————- 6

 

شکل 1-2  پراکندگی جنس بلوط(Quercus) در ایران———— 7

 

شکل 1-3  نمایی از گونه Quercus brantii Lindl.———— 10

 

شکل 1-4  نحوه اتصال پرایمرهای forward  و reverse به DNA الگوبلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد————– 20

 

شکل 1-5  واکنش زنجیره­ای پلی­مراز——— 24

 

شکل2- 1  جمعیت­ها و مناطق بررسی شده در این تحقیق———– 33

 

شکل2-2 نمونه­های برگ تازه در آزمایشگاه—– 34

 

شکل 2-3 دستگاه اسپکتروفتومتر برای تعیین کمیت DNA——– 38

 

شکل 2-4 دستگاه ترموسایکلر————- 41

 

شکل 2-5 دستگاه الکتروفورز عمودی——– 42

 

شکل 2-6 ساختار اتیدیوم برماید———– 42

 

شکل 2-7 دستگاه ژل داک—————- 43

 

شکل 3-1 الگوی باندی پرایمر————– 46

 

شکل 3-2 دندروگرام ژنوتیپ های مورد بررسی– 55

 

فهرست جداول:

 

جدول 2-1  اسامی جمعیت­ها و مناطق بررسی شده در این تحقیق—- 33

 

جدول 2-2  مواد استفاده شده در PCR—— 39

 

جدول 2-3  برنامهPCR -بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد 40

 

جدول 2-4  پرایمرهای مورداستفاده در آزمایش- 40