1-2-11، ایمنی                                                                                                19

 

1-2-12، درمان                                                                                                19

 

1-3 – مروری بر روش های تایپینگ باکتری ها                                                  20

 

1-3-1- اصول و مبانی روش MLVA                                                                    22

 

1-2-3- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA                                           24

 

1-3-3- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ                                26

 

1-4- اهداف پایان نامه                                                                              31

 

1-4-1- هدف علمی پایان نامه                                                                     31

 

1-4-2- اهداف جزئی                                                                               31

 

1-4-3- اهداف کاربردی                                                                                     31

 

1-5- فرضیه ها                                                                                       31

 

1-6- سئوالات                                                                                        31

 

1-7- ضرورت انجام تحقیق                                                                        32

 

1-8- جنبه جدید بودن و نوآوری تحقیق                                                          32

 

1-9- واژه نامه ها و اصطلاحات فنی                                                              32

 

فصل دوم مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه تحقیق                                                         34

 

بررسی متون:                                                                                           35

 

فصل سوم :مواد وروشها                                                                              39

 

3-1-مواد و تجهیزات                                                                                40

 

3-1-1-دستگاه ها ووسایل مورد نیاز:                                                              40

 

3-1-2-مواد مصرفی مورد نیاز:                                                                     41

 

3-1-3- محیطهای کشت مورد استفاده:                                                            41

 

3-2-ترکیبات و محلولهای مورد نیاز و فرمول ساخت آنها                                                42

 

3-2-1-تهیه محلول(%25) SDS:                                                                 42

 

3-2-2- محلول  EDTA(5/0 مولار):                                                           42

 

3-2-3-تامپون لیز کننده سلول                                                                      42

 

3-2-4- تامپون TE حاوی RNase                                                             42

 

3-2-5- بافر(5X)TBE:                                                                          42

 

3-2-7- محلول فنل-کلروفروم-ایزو آمیلیک الکل(PCI):                                                43

 

3-3- روش انجام طرح:                                                                             44

 

3-3-1- نوع مطالعه:                                                                                 44

 

3-3-2-جامعه مورد مطالعه:                                                                         44

 

3-3-3- جمع آوری اطلاعات:                                                                     44

 

3-3-4- انجام امور باکتریولوژیک:                                                                44

 

3-4- ژنوتایپینگ ایزوله های سالمونلا با استفاده از روش MLVA                                     46

 

3-4-1- انجام آزمایش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR                                      46

 

3-4-2- الکتروفورز محصولات VNTR                                                                  50

 

3-4-3- محاسبه ی اندازه و تعداد تکرار های VNTR                                         52

 

3-4-4-تجزیه و تحلیل داده های VNTR                                                       52

 

فصل چهارم یافته ها                                                                                  54

 

4-1- نمتایج حاصل از جمع آوری نمونه ها                                                       55

 

4-2- نتایچ حاصل از استخراج ژنوم باکتریایی                                                    57

 

4-3- نتایج حاصل از واکنش PCR جهت تکثیر لوکوس های VNTR                      58

 

4-4- میزان تنوع الل های VNTR                                                                74

 

4-5- آنالیز داده ها با استفاده از الگوریتم Minimum Spanning Tree                           74

 

4-6- آنالیز داده های VNTR با استفاده از روش NJ                                          75

 

فصل پنجم :بحث ونتیجه گیری                                                                      77

 

5-1- بحث                                                                                           78

 

5-2- نتیجه گیری و جمع بندی                                                                     91

 

منابع:                                                                                                    92

 

چکیده انگلسی                                                                                        96

 

فهرست جداول و نمودارها

 

عنوان                                                                                     صفحه

 

 

جدول1-1، ویژگی های بیو شیمیایی سالمونلا                                                     8

 

جدول 1-2، طبقه بندی نوین سالمونلا و میزان سروتایپ ها در زیر گونه ها                            9

 

جدول 3-1، نام لوکوس ها و پرایمر های اختصاصی                                             47

 

جدول 3-2،مقادیرموردنیازجهت انجام واکنش هایPCRبرای تکثیرلوکوس­هایVNTR    48

 

جدول 3-3، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس های SENTR2،

 

SENTR3 و SE-7                                                                               49

 

جدول3-4،برنامه ریزی دستگاه­ترموسایکلرجهت تکثیرلوکوس­هایENTR6وSE-8                  49

 

جدول 3-5، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر برای تکثیر لوکوس SE-4                       49

 

جدول 3-6،  برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس SE-10                            50

 

جدول 3-7، برنامه ریزی دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر لوکوس  SE-6                    50

 

جدول 4-1، در فایل EXCEL                                                                    73

 

جدول 4-2، ضریب تنوع هانتر- گاتسون برای هر لوکوس محاسبه شده                        74

 

نمودار 4-1، میزان فراوانی هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر            56

 

نمودار 4-2، میزان شیوع هر یک از سرو تایپ های سالمونلا در پژوهش حاضر              56

 

فهرست اشکال

 

عنوان                                                                                    صفحه

 

شکل 1-1 تصویر دکتر سالمون دامپزشک آمریکایی.                                              5

 

شکل1-2 باکتری سالمونلا                                                                           6

 

شکل 1-4مای شماتیک از VNTR ها                                                            23

 

شکل 1-5 پروفایل اللی                                                                                       24

 

شکل 1-6 آنالیز MLVA بوسیله MST                                                                   25

 

شکل 1-7، مزایای  MLVA                                                                       26

 

شکل 1-8، مراحل انجام MLVA                                                                 27

 

شکل 4-1، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 53                                        57

 

شکل 4-2، میزان خلوص DNA نمونه ی شماره ی 24                                        57

 

شکل 4-3، لوکوس ENTR6                                                                      58

 

شکل 4-4، لوکوس SE4                                                                           59

 

شکل 4-5، لوکوس SE4                                                                           60

 

شکل  4-6، لوکوسSE6                                                                           61

 

شکل 4-7، لوکوس SE6                                                                           62

 

شکل 4-8، لوکوسSE7                                                                            63

 

شکل 4-9، لوکوسSE7                                                                             64

 

شکل 4-10، لوکوسSE8                                                                          65

 

شکل 4-11، لوکوسSE8                                                                          66

 

شکل 4-12، لوکوسSE10                                                                        67

 

شکل 4-13، لوکوسSE10                                                                        68

 

شکل 4-14، لوکوسSENTR2                                                                   69

 

شکل 4-15، لوکوسSENTR2                                                                   70

 

شکل 4-16، لوکوسSENTR3                                                                   71

 

شکل 4-17، لوکوسSENTR3                                                                   72

 

شکل 4-18، آنالیز داده های VNTR با استفاده از الگوریتم MST.                          75

 

شکل  4-22، درختچه ی NJ                                                                      76  

 

 

 

چکیده فارسی :

 

مقدمه:سالمونلاانتریکا سبب ایجاد سالمونلوزیس در انسان می شود. سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس، دومین سروتایپی می باشد که در سطح دنیا سبب ایجاد سالمونلوزیس می شود. تکنیک MLVA، یکی از روش های نوین ژنوتایپینگ جهت تمایز ایزوله های باکتریایی در همه گیری ها و یا تعیین قرابت فیلوژنتیکی این ایزوله ها می باشد. هدف از این پژوهش، ژنوتایپینگ سویه های سالمونلا انتریتیدیس جدا شده از نمونه های بالینی  در تهران  بر پایه ی روش MLVA.

 

مواد و روش ها: در این پژوهش، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس از نمونه های بالینی در طی سال های 1387 تا 1389 در تهران جدا شدند. ایزوله های سالمونلا انتریتیدیس با استفاده از تکنیک های بیوشیمیایی و سرولوژیکی تایید شدند. جهت انجام تکنیک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.

 

نتایج: 10 ژنوتایپ متفاوت MLVA، در این پزوهش شناسایی شد. با استفاده از روش MST، 51 ایزوله ی سالمونلا انتریتیدیس در 2 کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنین با استفاده از تکنیک NJ، این ایزوله ها در دو کلاستر جای گرفتند.

 

1-4-4  ژنتیک و آترواسکلروزیس……………………………………………………………………………………. 17

 

1-4-4-1  ژنتیک های Dyslipidemia……………………………………………………………….. 17

 

1-4-4-2  پلی مورفیسم های ژنتیکی در نیتریک اکسیدسنتاز اندوتلیالی…………….. 18

 

1-4-4- 3  پلی مورفیسم هادر گلوتاتیون پراکسیداز ( GPx )…………………………….. 18

 

1-4- 4-4  پلی مورفیسم های افزایش هموسیستئین…………………………………………….. 19

 

1-4-4-5  پلی مورفیسم هایی در فیبرینوژن……………………………………………………………. 19

 

1-4-4-6  واریانت های میتوکندریایی………………………………………………………………………. 20

 

1-4-5  نقش آلودگی………………………………………………………………………………………………………… 21

 

1-5  عواملی که در آترواسکلروزیس جلوگیری می کند………………………………………………………. 21

 

1-5-1  استروژن ها…………………………………………………………………………………………………………… 21

 

1-5- 2  آنتی اکسیدان ها  و عمکرد آنها………………………………………………………………………… 21

 

1-5-3  پرهیزهای غذایی………………………………………………………………………………………………….. 22

 

1-5-4  ورزش……………………………………………………………………………………………………………………. 23

 

1-6  سیستم RAAS و عملکرد آن……………………………………………………………………………………. 23

 

1-7  طبقه بندی ترکیبات RAAS و ویژگی شان…………………………………………………………….. 25

 

1-7-1  رنین……………………………………………………………………………………………………………………… 25

 

1-7-2  آنژیوتانسینوژن ، آنژیوتانسین 1 و 2…………………………………………………………………. 25

 

1-7-3  آنزیم مبدل آنژیوتانسین 1 (ACE ) و آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 ( ( ACE2.  26

 

1-7-4  رسپتورهای 1 و 2………………………………………………………………………………………………. 27

 

1-8  التهاب و سیستمRAAS…………………………………………………………………………………………….. 29

 

1-9  واریانت ها در ژن AGT……………………………………………………………………………………………….. 30

 

1-10 RAAS  موضعی……………………………………………………………………………………………………….. 30

 

1-10-1 RAAS  موضعی در قلب……………………………………………………………………………….. 31

 

1-11  تولید آنژیوتانسین بافتی……………………………………………………………………………………………… 31

 

1-11- 1 تولید آنژیوتانسین در جریان درونی ( بین شکاف )……………………………………….. 31

 

1-11-2 تولید آنژیوتانسین در غشاء سلولی……………………………………………………………………. 32

 

1-11-3  تولید آنژیوتانسین در داخل سلول…………………………………………………………………… 32

 

1-12  تاثیرات RAAS  روی سلول های قلبی………………………………………………………………….. 33

 

1-13  تاثیرات RAAS روی جریان کرونری………………………………………………………………………. 34

 

1-14  تاثیرات RAAS روی جریان منظم شریان……………………………………………………………… 34

 

1-15  جداسازی و خالص سازی DNA……………………………………………………………………………… 36

 

1-16 واکنش زنجیره پلی مراز  ……………………………………………………………………………………………. 38

 

1-16-1  مراحل اصلی در واکنش زنجیرۀ پلی مراز………………………………………………………. 39

 

1-16-2 طراحی پرایمر  ………………………………………………………………………………………………….. 40

 

1-16-3 دمای اتصال پرایمر  ……………………………………………………………………………………………. 41

 

1-17  الکتروفورز…………………………………………………………………………………………………………………….. 42

 

1-18  روش آشکارسازی اسیدنوکلئیک………………………………………………………………………………… 43

 

1-19  یافتن جهش ها با روش PCR – SSCP………………………………………………………………. 44

 

1-20 تعیین توالی بازهای DNA ………………………………………………………………………………………. 46

 

1-21 مروری بر مطالعات گذشته…………………………………………………………………………………………… 48

 

1-22 اهداف تحقیق……………………………………………………………………………………………………………….. 52

 

2   فصل دوم : مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………….. 53

 

2-1  مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………… 54

 

2-2  بافرها و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………… 55

 

2-2-1  روش تهیه EDTA……………………………………………………………………………………………. 55

 

2-2-2  روش تهیه الکل 75/…………………………………………………………………………………………… 55

 

2-2-3  روش تهیه پرایمرها………………………………………………………………………………………………. 55

 

2-2-4  روش تهیه اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………………….. 55

 

2-2-5  روش تهیه بافر TBE 10X……………………………………………………………………………… 56

 

2-2-6  روش تهیه بافر TBE ./5X……………………………………………………………………………… 56

 

2-2-7  روش تهیه لودینگ بافر PCR…………………………………………………………………………… 56

 

2-2-8  روش تهیه لودینگ بافر SSCP………………………………………………………………………… 57

 

2-2-9  روش تهیه محلول NAOH………………………………………………………………………………. 57

 

 

2-2-10  روش تهیه آمونیوم پرسولفات 10/………………………………………………………………….. 57

 

2-3  کیت استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 57

 

2-4  تکنیک PCR………………………………………………………………………………………………………………… 59

 

2-4-1  شرایط تکثیر قطعه مورد نظر……………………………………………………………………………… 60

 

2-4-2  مراحل PCR………………………………………………………………………………………………………. 61

 

2-5  الکتروفورز ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………………… 61

 

2-6  آنالیز ژل SSCP…………………………………………………………………………………………………………… 62

 

2-7  آماده سازی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………………………………………… 62

 

2-8  مراحل رنگ آمیزی ژل SSCP…………………………………………………………………………………… 63

 

3  فصل سوم : نتایج…………………………………………………………………………………………………………………………. 64

 

4  فصل چهارم : بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………… 72

 

4-1  نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………. 76

 

4- 3  پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………… 77

 

4-4  مراجع……………………………………………………………………………………………………………………………… 78

 

عنوان                                                   فهرست شکل ها                                      صفحه

 

شکل 1-1: مکانیسم پیشنهادی در وقوع آترواسکلروزیس……………………………………………………………….. 10

 

شکل 1-2 : خلاصه ای از تاثیرات HDL-C………………………………………………………………………………….. 15

 

شکل 1-3 : کل عملکرد سیستم RAAS………………………………………………………………………………………. 24

 

شکل 1-4 : مسیر کلاسیک و غیر کلاسیک RAAS ………………………………………………………………….. 28

 

شکل 1-5 : ساختار پروتیین های درگیر در سیستم RAAS …………………………………………………….. 29

 

شکل 1-6 : طرح پیشنهادی تولید آنژیوتانسین 1 و 2 درقلب……………………………………………………….. 33

 

شکل 1-7 : تاثیرات آنژیوتانسین 2 روی قلب………………………………………………………………………………….. 35

 

شکل 1-8 : مراحل زنجیره پلی مراز…………………………………………………………………………………………………. 40

 

شکل 1-9 : ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………………………………………………… 43

 

شکل 1-10 : روش SSCP …………………………………………………………………………………………………………….. 46

 

شکل 3-1 : تصویری از الکتروفورز محصول PCR نمونه های مورد مطالعه بر روی ژل آگاروز…. 65

 

شکل 3-2 : تصویری از آنالیز SSCP روی ژل پلی آکریل آمید…………………………………………………… 66

 

شکل 3-3 : تشخیص جهش 4360C>T  با استفاده از تکنیک SSCP  و تعیین توالی………… 67

 

شکل 3-4 : تشخیص جهش 4543T>C  با استفاده از تکنیک SSCP  و تعیین توالی………… 67

 

شکل 3-5 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر 4360C>T……………………………………………………………. 68

 

شکل 3-6 : هم ردیفی نوکلئوتید برای تغییر4543T>C…………………………………………………………….. 65

 

شکل 3-7 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر T207M …………………………………………………………………. 66

 

شکل 3-8 : هم ردیفی پروتیین برای تغییر M268T …………………………………………………………………. 66

 

شکل 3-9 : نتیجه Blastn برای جهش 4360C> T همولوگ با حیوان pan paniscus… 67

 

شکل 3-10 : نتیجه Blastn  برای جهش 4543T> C همولوگ با حیوان pan paniscus…..  67

 

عنوان                                                      فهرست جداول                                       صفحه

 

جدول 1-1 : فعالیت های رسپتور نوع یک و دو آنژیوتانسین 2…………………………………………………….. 28

 

جدول 1-2 : مواد لازم جهت تهیه ژل SSCP با درصدهای مختلف……………………………………………. 45

 

جدول 2-1 : مشخصات بیماران…………………………………………………………………………………………………………. 55

 

جدول 2-2 : مشخصات پرایمر در این مطالعه………………………………………………………………………………….. 59

 

جدول 2-3 : مقدار مواد مورد استفاده در مخلوط PCR در حجم Lµ25………………………………….. 60

 

چکیده :

 

آترواسکلروزیس “بیماری اصلی عروق کرونر قلب”  بیماری است که بر روی شریان های بزرگ و متوسط بدن تاثیر می گذارد.  انواع متفاوتی از سلول ها، اندام ها و شماری از فرآیندهای فیزیولوژیکی در این عارضه درگیر هستند. سیستمRAAS  یک سیستم مهم در تنظیم فشارخون، آب و الکترولیت های بدن انسان و سایر موجودات زنده است. مطالعه وسیعی روی واریانت های ژن های کد کنندۀ این سیستم، که باعث گسترش فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس می گردد، صورت گرفته است. ژنAGT  نخستین ژنی است که با فشارخون بالا ارتباط دارد و واریانت های این ژن احتمالا با افزایش فشارخون و گسترش آترواسکلروزیس مرتبط هستند.

 

این مطالعه بر روی دومین اگزون ژن AGT  (آنژیوتانسین) بر روی 70 فرد مبتلا به آترواسکلروزیس انجام گرفت. پس از استخراج DNA از نمونه ها و PCR ، ژن تکثیر شده با روش SSCP ⁵ برای یافتن پلی مورفیسم یا تغییرات جدید در ژن، مورد بررسی قرار گرفت. هفت مورد از نمونه های دارای شیفت باندی برای تعیین ماهیت تغییر، تعیین توالی شدند. در این بررسی دو جهش در موقعیت های 4543T>C و 4360C>T  مشخص شد، که در جهش اول متیونین موقعیت 268 به تروئونین (M268T) و در جهش دوم در کدون 207 اسیدآمینه تروئونین به متیونین (T207M) تبدیل می گردد. این تغییرات احتمالا افزایش غلظت های پلاسمایی AGT  و افزایش فشارخون را به همراه دارند.

 

2-4 ارتقاء زیستی یا Bio upgrading ……………………………………………………………………….21

 

2-5 تولید اولیه نفت…………………………………………………………………………………………………..21

 

2-5-1 تولید اسید آلی که منجر به انحلال سنگهای کربناتی و توسعه کانال ها می شود………….21

 

2-5-2 احیای گوگرد ونیترات در ترکیبات گچی و انیدریدی و مواد معدنی سولفاتی که نفت

 

به دام افتاده در آنها را آزاد میکند………………………………………………………………………………..22

 

2-5-3 تولید گازهایی از قبیل متان، دی اکسیدکربن،هیدروژن و نیتروژن که نفت را از فضاهای

 

مرده به خارج می رانند………………………………………………………………………………………………22

 

2-6 تجزیه بیولوژیک نفت………………………………………………………………………………………….23

 

2-7 اثرات سوء آلودگی های نفتی تحت تاثیر برخی عوامل مهم به شرح زیر قرار میگیرند………23

 

2-7-1 حجم نفت……………………………………………………………………………………………………..23

 

2-7-2 نوع نفت………………………………………………………………………………………………………..24

 

2-8 آلودگی های نفتی………………………………………………………………………………………………24

 

فصل سوم

 

روش کار

 

3-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………26

 

3-2 هدف کاربردی این بخش……………………………………………………………………………………27

 

3-3 دستگاه ها و وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………..27

 

3-4 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………28

 

3-5 روش کار…………………………………………………………………………………………………………29

 

3-5-1 مرحله اول……………………………………………………………………………………………………31

 

3-5-2 مرحله دوم روش تلقیح و کشت باکتری ……………………………………………………………32

 

3-5-3 مرحله سوم روش رنگ آمیزی منفی…………………………………………………………………33

 

3-5-4 مرحله چهارم روش رنگ امیزی گرم………………………………………………………………..34

 

3-5-5 مرحله پنجم شروع غربالگری پس از هفته هشتم………………………………………………….34

 

3-5-6 مرحله ششم محیط کشت اختصاصی جامد برای جداسازی باکتری احیا کننده نیترات .35

 

3-5-7 مرحله هفتم روش تهیه سریال رقت…………………………………………………………………..35

 

3-6 تست احیای نیترات……………………………………………………………………………………………37

 

3-7 تست CHN ……………………………………………………………………………………………………37

 

3-7-1 خلاصه ای از ویژگی های تست CHN ……………………………………………………………38

 

3-8 غربالگری در محیط کشت غنی شده BHI ……………………………………………………………39

 

فصل چهارم

 

نتایج

 

4-1مشاهدات میکروسکوپی……………………………………………………………………………………41

 

4-2 غنی سازی……………………………………………………………………………………………………..41

 

4-3 نتایج کشت اختصاصی نیترات براث……………………………………………………………………42

 

4-4 نتایج تست احیای نیترات………………………………………………………………………………….42

 

4-5 نتایج کشت در محیط BHI………………………………………………………………………………43

 

4-6 نتایج تست CHN …………………………………………………………………………………………..44

 

4-7 تفسیر نتایج تست CHN ………………………………………………………………………………….45

 

فصل پنجم

 

بحث و نتیجه گیری

 

5-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………….48

 

5-2 بیوتکنولوژی و اهمیت بیوتکنولوژی نفت…………………………………………………………..48

 

5-3 بحث…………………………………………………………………………………………………………..52

 

5-4 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………..55

 

5-5 پیشنهادات………………………………………………………………………………………………….56

 

پیوست الف ………………………………………………………………………………………………………57

 

منابع فارسی……………………………………………………………………………………………………….58

 

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..58

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1 نسبت ترکیبی نفت خام………………………………………………………………………………………………………..3

 

جدول 4-1 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه شاهد…………………………………………………………………………………..44

 

جدول 4-2 مقادیر آنالیز عنصری در نمونه MSM ……………………………………………………………………………..45

 

 

فهرست نمودار

 

نمودار1-1 قیمت های نفت خام به صورت واقعی و صوری …………………………………………………………………10

 

چکیده

 

حضور وسیع باكتریهای بی‌هوازی و آركی‌ها در سیستم نفتی زیرزمین به وسیله بسیاری از مطالعات مورد بررسی قرار گرفته است.  فرآیندهای آرام بی‌هوازی در زیر زمین فراوان می‌باشد كه به همراه تجزیه زیرزمینی هیدروكربن‌ها كه در ارتباط با احیای نیترات و متانوژنز و یا در مخازن نفتی در جائیكه وفور سولفات وجود دارد، به همراه احیای سولفات است. میكروارگانیزم‌هایی كه قادر به استفاده از نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی و كربن می‌باشند، با تولید یكسری محصولات جانبی و یا با شكستن تركیبات هیدروكربنی سنگین كمك شایانی در رفع مشكلات موجود در صنعت نفت کرده اند.

 

در این مطالعه باکتری هایی از منطقه ی لاوان ، سکوی سلمان واقع در استان خوزستان جداسازی شدند که دارای قابلیت استفاده از هیدروکربن های ازته به عنوان تنها منبع کربن، ازت و انرژی بطور موثر بود. تحقیقات نشان می دهد که این باکتریهای بی هوازی قادرند برخی ترکیبات کمپلکس ، حلقوی و خطی نفت خام را تجزیه کرده و از ازت موجود در این ترکیبات استفاده کنند. هدف از این مطالعه بررسی باکتری های مصرف کننده نفت خام به عنوان تنها منبع انرژی ، ازت و کربن و تجزیه ی آن به مواد قابل بازیافت و تعیین شرایط بهینه ی رشد آنها می باشد. نمونه ها پس از نمونه گیری در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند و در محیط های رشد مناسب کشت داده شدند. در ابتدا برای بی هوازی کردن محیط کشت از روش Hungate استفاده کرده و با استفاده از   serum bottle وcrimped seal کردن و در نهایت تنظیم گاز، محیط رشد باکتری ها  به صورت بی هوازی تهیه شدند. نمونه ها در محیط کشت BSM کشت داده شدند سپس به دلیل fastidious بودن باکتری های بی هوازی در محیط کشت MSM که یک محیط حداقل نمکی می باشد و حاوی 1٪ نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بود کشت صورت گرفت. غنی سازی نمونه ها با افزودن 0.01٪ گلوکز و نیز محلول ویتامین ها و Trace mineral به محیط کشت انجام شد. استفاده از محیط کشت اختصاصی نیترات براث برای کشت باکتری ها در این مرحله صورت گرفت تا از سایر باکتری های بی هوازی رشد کرده در محیط جدا شوند. در محیط نیترات براث پس از مشاهده ی تغییر رنگ محیط کشت از وجود باکتری های تجزیه کننده ی نیترات (NRB  )  اطمینان حاصل شد. در مراحل بعد برای جدا کردن کلنی به دلیل عدم دسترسی به گلاو باکس میکروبی کشت در محیط کشت شیب دار با استفاده از serum bottle و جوشاندن محیط کشت برای خارج کردن اکسیژن محلول در آن و تنظیم گاز با purge کردن گاز ازت در آن به صورت بی هوازی کشت انجام شد. اضافه کردن محلول ویتامین ها نیز در همه مراحل کشت انجام شد. تست احیای نیترات جهت انتخاب بهترین سویه در شرایط بی هوازی و رشد در محیط غنی شده انجام شد و جهت بررسی عملکرد باکتری روی ساختار نفت و چگونگی تغییرات ایجاد شده در ساختار نفت توسط باکتری های NRB جدا شده، از تست CHN استفاده شد تا کاهش مقدار ازت مشخص گردد.

 

کلمات کلیدی :  نفت خام ، باکتری احیا کننده نیترات ، بی هوازی ، پر نیاز ، باکتری احیا کننده سولفات

 

فصل اول

 

 

کلیات

 

 

 

• مقدمه

   

 

نفت خام کمپلکس ترکیبی است که بطور عمده از هیدروکربن های متغیر اشباع شده و اشباع نشده تشکیل شده است. بیوتکنولوژی نفت مجموعه ای از متد و روش ها برای تولید، تغییر و اصلاح فراورده ها و تولید میکروارگانیسم ها برای کاربردهای ویژه است. مثلا تحقیقات در زمینه ی MEOR (Microbial Enhanced Oil Recovery) بمنظور افزایش برداشت از چاه های نفت به روش های میکروبی به منظور استخراج بیشتر نفت می باشد . میکروارگانیسم ها ابزار اصلی تحقیق در زمینه ی بیوتکنولوژی هستند که شامل باکتری ها، قارچ ها، جلبک ها ومیکروب هایی که در حوزه ی نفت در فرآیندهای پالایش-انتقال-تغییر و تبدیل مواد ،محیط زیست و خوردگی از ابزارهای اصلی بشمار می روند می باشند. که این منوط به حفظ و نگهداری میکروارگانیسم ها بدون کمترین تغییر ژنتیکی میباشد. در بخش مطالعات مخزن  در ایران برای اولین بار مطالعه ی مخزن آزادگان با یک شرکت نروژی  Sintef انجام شده روی سه میدان بزرگ نفت مارون، بی بی حکیمه و اهواز مشترک  با شرکت نروژی استات اویل مطالعه شده.  از 6/3 میلیون بشکه نفت 5/1 میلیون بشکه از این سه میدان تامین شده است. مطالعه جامع میدان (F.F.S )  و توسعه ی میدان ( M.D.D ) روی این زمینه فعالیت می کنند. مطالعه ی دیگر با شرکت روسی تاتنفت در زمینه ی ازدیاد برداشت به روش میکروبی میباشد که کار بزرگ و منحصر به فردی است.  در ایران 3 منطقه ی نفتی وجود دارد: زاگرس ، منطقه ی ایران مرکزی  و منطقه ی کپه داغ که ایران مرکزی در فارس و شمال بندر عباس  و کپه داغ در شرق گرگان و شمال شرق ایران قرار دارد. نفت خام ایران متشکل از مواد آلی است که قسمت اعظم آن کربن و هیدروژن همراه با مقادیر کم گوگرد ، ازت ، اکسیژن و مقادیر جزئی فلزات از جمله نیکل ، وانادیوم و…. میباشد. ( جدول 1-1 )

 

 

 

(جدول 1-1) نسبت ترکیبی نفت خام

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنصر	حداقل درصد وزنی	حداکثر درصد وزنی
کربن	2/82	1/87
هیدروژن	8/11	7 / 14
گوگرد	1/0	5/5
اکسیژن	1/0	5/4
نیتروژن	1/0	5/1

 

 

1-1-بیان مسئله……………………………………………………………………………………………………………………………..5

 

 

 

فصل دوم (مروری بر ادبیات تحقیق و پیشینه آن)……………………………………………………………………………….7

 

 

 

2-1-کلیات (تاریخچه سابقه مطالعه و تحقیق کفزیان در ایران و جهان ………………………………………………….8

 

 

 

2-2-معرفی استان سمنان…………………………………………………………………………………………………………………9

 

 

 

2-3-چشمه های استان سمنان ……………………………………………………………………………………………………….11

 

 

 

2-4-معرفی مهم ترین راسته ها و خانواده های ماکروبنتوزهای آبهای شیرین ایران………………………………….12

 

 

 

2-5-راسته بهاره ها (پلکوپترا)……………………………………………………………………………………………………….12

 

 

 

2-6-راسته یکروزه ها(افموپترا)………………………………………………………………………………………………………16

 

 

 

2-7-راسته دوبالان (دیپترا)…………………………………………………………………………………………………………….23

 

 

 

2-8-بال موداران(تریکوپترا)…………………………………………………………………………………………………………..32

 

 

 

2-9-راسته ناجورپایان(آمفی پودا)…………………………………………………………………………………………………..37

 

 

 

2-10-رده تورکیان……………………………………………………………………………………………………………………….38

 

 

 

فصل سوم (مواد و روش کار)………………………………………………………………………………………………………….40

 

 

 

3-1-نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………………..41

 

 

 

3-2-وسایل نمونه برداری کفزیان…………………………………………………………………………………………………..41

 

 

 

3-3-نگهداری نمونه ها ………………………………………………………………………………………………………………..43

 

 

 

3-4-شناسایی ماکروبنتوزها……………………………………………………………………………………………………………43

 

 

 

3-5-دانه بندی رسوبات و تعیین موادآلی………………………………………………………………………………………….43

 

 

 

3-6-تعیین موقعیت ایستگاههای مطالعاتی………………………………………………………………………………………..44

 

 

 

3-7-منطقه مورد بررسی………………………………………………………………………………………………………………..47

 

 

 

3-8-عملیات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………………………………..52

 

 

 

3-9-سنجه یا معیار جمعیتی………………………………………………………………………………………………………….52

 

 

 

3-10-شاخص ها…………………………………………………………………………………………………………………………53

 

 

 

 

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………….56

 

 

 

4-1-رده بندی نمونه های موجود……………………………………………………………………………………………………57

 

 

 

فصل پنجم (بحث)………………………………………………………………………………………………………………………99

 

 

 

5-1-بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………..100

 

 

 

5-2-پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………..107

 

 

 

منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………………109

 

 

 

منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………………………109

 

 

 

2-1-1-3.میکرو استخراج فاز مایع با استفاده از انجماد حلال استخراج کننده………………………… 22

 

2-1-1-4.میکرو استخراج فاز مایع- مایع پخشی (DLPME) ………………………………………….. 22

 

2-1-2.استخراج فاز جامد ……………………………………………………………………………………….. 23

 

2-2. کروماتوگرافی ………………………………………………………………………………………………… 23

 

2-2-1. دسته‌بندی روش‌های کروماتوگرافی …………………………………………………………………. 24

 

2-2-1-1. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)…………………………………………………….. 24

 

2-2-1-2. دستگاه‌های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………… 26

 

2-2-1-2-1.مخزن فاز متحرک…………………………………………………………………………………. 26

 

2-2-1-2-2. سیستم‌های پمپ کننده ………………………………………………………………………….. 27

 

2-2-1-2-3. سیستم‌های تزریق نمونه ………………………………………………………………………… 28

 

2-2-1-2-4. ستون‌های کروماتوگرافی مایع …………………………………………………………………. 28

 

2-2-1-2-4-1. انواع پر کننده‌های ستون ……………………………………………………………………. 29

 

2-2-1-2-5. دمای ستون ……………………………………………………………………………………….. 29

 

2-2-1-2-6. آشکارسازها ………………………………………………………………………………………. 30

 

2-2-1-2-6-1.آشکارساز فتومتریک …………………………………………………………………………. 31

 

2-2-1-2-6-2.آشکارساز جذب فرابنفش (UV)………………………………………………………….. 32

 

2-3.بررسی مطالعات دیگران در این زمینه ……………………………………………………………………. 33

 

2-4.بررسی داروی مورد مطالعه …………………………………………………………………………………. 36

 

2-4-1.مکانیسم اثر فارماکوکینتیک دارو………………………………………………………………………… 36

 

2-4-2.مکانیسم اثر………………………………………………………………………………………………….. 37

 

2-4-3. موارد مصرف …………………………………………………………………………………………….. 37

 

2-4-4.منع مصرف و احتیاط ……………………………………………………………………………………. 37

 

2-4-5.عوارض جانبی …………………………………………………………………………………………….. 38

 

2-4-6. تداخل‌ها …………………………………………………………………………………………………… 38

 

2-4-7.دوز مصرفی ……………………………………………………………………………………………….. 38

 

2-5. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل………………………………….. 38

 

2-5-1.از دلایل انتخاب این روش………………………………………………………………………………. 39

 

فصل سوم: مواد و روش‌ها

 

3-1.مواد شیمیایی و تجهیزات دستگاهی……………………………………………………………………….. 41

 

3-2-1. مواد شیمیایی، استانداردها و نمونه‌های حقیقی …………………………………………………….. 41

 

3-2-2.تجهیزات دستگاهی ………………………………………………………………………………………. 41

 

3-3.روش استخراج ………………………………………………………………………………………………… 42

 

3-3-1.استخراج به اختصار طی مراحل زیر انجام گرفت…………………………………………………… 42

 

3-3-2. مراحل بهینه‌سازی ……………………………………………………………………………………….. 43

 

3-3-2-1. بهینه‌سازی شرایط جداسازی……………………………………………………………………….. 43

 

3-3-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………….. 43

 

3-3-2-2-1.نوع حلال آلی …………………………………………………………………………………….. 44

 

3-3-2-2-2.اثرpHفاز دهنده ……………………………………………………………………………………. 44

 

3-3-2-2-3.اثرpHفاز گیرنده …………………………………………………………………………………… 44

 

3-3-2-2-4.اثر قدرت یونی فاز دهنده ………………………………………………………………………. 44

 

3-3-2-2-5.اثر هم زدن محلول آنالیت ………………………………………………………………………. 44

 

3-3-2-2-6.اثر زمان استخراج …………………………………………………………………………………. 44

 

3-3-3. ارزیابی کارایی روش استخراج ……………………………………………………………………….. 45

 

3-3-3-1. منحنی درجه‌بندی ……………………………………………………………………………………. 45

 

3-3-3-2.تعیین فاکتور پیش تغلیظ (PF) ……………………………………………………………………. 45

 

3-3-3-3. تعیین تکرارپذیری (RSD) ………………………………………………………………………… 46

 

3-3-4.آنالیز نمونه حقیقی ……………………………………………………………………………………….. 46

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1. میکرواستخراج سه فازی بر پایه استفاده از فیبر توخالی متخلخل …………………………………. 48

 

4-2. مراحل بهینه‌سازی…………………………………………………………………………………………….. 48

 

4-2-1. بهینه‌سازی شرایط HPLC………………………………………………………………………………. 48

 

4-2-2. بهینه‌سازی شرایط استخراج ……………………………………………………………………………. 49

 

4-2-2-1.نوع حلال آلی………………………………………………………………………………………….. 49

 

 

4-2-2-2.طراحی آزمایش………………………………………………………………………………………… 51

 

4-2-2-2-1. غربال‌گری …………………………………………………………………………………………. 51

 

4-2-2-2-2. طراحی بهینه‌سازی ………………………………………………………………………………. 55

 

4-2-2-2-3. خلاصه نتایج بهینه‌سازی ……………………………………………………………………….. 59

 

4-3. تعیین پارامترهای تجزیه‌ای روش استخراج …………………………………………………………….. 59

 

4-3-1.تهیه منحنی درجه‌بندی …………………………………………………………………………………… 59

 

4-3-2.فاکتور پیش تغلیظ (PF) و درصد بازیابی (R%) …………………………………………………. 60

 

4-3-3.تعیین حد تشخیص (LOD) …………………………………………………………………………… 61

 

4-3-4. تکرارپذیری روش (RSD) ……………………………………………………………………………. 62

 

4-4.آنالیز نمونه ادرار و پلاسما ………………………………………………………………………………….. 62

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1. بحث و نتیجه‌گیری…………………………………………………………………………………………… 66

 

5-2. پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………… 69

 

منابع…………………………………………………………………………………………………………………….. 70

 

خلاصه انگلیسی …………………………………………………………………………………………………….. 82

 

ضمایم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 82

 

 

 

فهرست جداول

 

عنوان                                                                                                           صفحه

 

جدول 2-1. کاربردهای کروماتوگرافی تقسیمی ……………………………………………………………… 25

 

جدول 2-2. کاربردهای اخیر HF-LPME در استخراج گونه‌های مختلف ……………………………… 33

 

جدول 4-1. سطوح پایین و بالای مربوط به فاکتورهای بررسی شده ……………………………………. 52

 

جدول 4-2. آزمایشات طراحی شده پلاکت- بورمان جهت شناسایی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر روی نتایج SBME-HPLC برای جداسازی و اندازه‌گیری donepezil…………………….. 52

 

جدول 4-3. آزمایشات طراحی شده باکس- بهکن جهت بهینه‌سازی فاکتورهای موثر بر SBME…. 55

 

جدول 4-4. خلاصه نتایج بهینه‌سازی استخراج……………………………………………………………….. 59

 

جدول 4-5. ارقام شایستگی SBME داروی دونپزیل……………………………………………………….. 62

 

جدول 5-1. مقایسه روش ارائه شده با سایر روش‌های استخراجی……………………………………….. 66

 

فهرست اشکال

 

عنوان                                                                                                            صفحه

 

شکل ( الف ). روش‌های استخراج و میکرواستخراج ………………………………………………………….. 3

 

شکل 2-1. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با حلال با استفاده از میله تفلونی …………………. 11

 

شکل 2-2. نمای جانبی از سیستم میکرواستخراج با تک قطره الف)استخراج مستقیم ازدرون محلول

 

ب)استخراج از فضای فوقانی ……………………………………………………………………………………………. 13

 

شکل 2-3. اصول استخراج HF-LPME (الف) دو فازی (ب) سه فازی ………………………………. 14

 

شکل 2-4. (الف) سیستم HF-LPME بر اساس پیکربندی (ب) پیکربندی میله‌ای U………………… 17

 

شکل 2-5. طرح شماتیک از سیستم HF-LPME…………………………………………………………….. 18

 

شکل 2-6. (الف): شمایی از سیستم HF-LPME از حجم زیاد (ب) سیستم نیمه خودکار …………. 19

 

شکل 2-7. طرح شماتیک میکرواستخراج فاز مایع به روش مستقیم (الف) و (ب) فضای فوقانی .. 21

 

شکل 2-8. شمایی از یک دستگاه HPLC……………………………………………………………………… 26

 

شکل 2-9. یک حلقه نمونه‌برداری کروماتوگرافی مایع …………………………………………………….. 28

 

شکل 2-10. سلول آشکارساز فرابنفش برای HPLC………………………………………………………… 32

 

شکل 2-11. ساختار شیمیایی دونپزیل …………………………………………………………………………. 36

 

شکل 4-1.کروماتو گرام تزریق مستقیم 1میلی‌گرم بر لیتر محلول ابی دونپزیل ………………………… 49

 

شکل 4-2. بررسی نوع حلال پر کننده منافذ فیبر ……………………………………………………………. 50

 

شکل 4-3. نمودار Pareto chart مربوط به طراحی پلاکت- بورمان …………………………………….. 54

 

شکل 4-4. نمودار مربوط به میزان و نحوه تغییر سطوح فاکتورهای موثر انتخاب شده ………………. 56

 

شکل 4-5. نمودار پاسخ سطحی تخمینی و خطوط کانتور به دست آمده از فاکتورهای موثر در کارایی استخراج donepezil توسط روش SBME-HPLC………………………………………………………………………………………. 57

 

شکل 4-6. منحنی درجه‌بندی در شرایط بهینه SBME 59

 

شکل 4-7. منحنی درجه‌بندی در محیط آبی حاصل از تزریق دارو قبل از استخراج ………………………………… 60

 

شکل 4-8. منحنی درجه‌بندی تزریق مستقیم ………………………………………………………………….. 61

 

شکل 4-9. کروماتوگرام نمونه ادرار حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو………………………………….. 63

 

شکل 4-10. کروماتوگرام نمونه پلاسما حاوی 10 میکروگرم بر لیتر دارو……………………………… 64

 

 

 

خلاصه فارسی

 

داروی دونپزیل یک مهار کننده مرکزی آنزیم استیل کولیناستراز است که در موارد خفیف تا شدید بیماری آلزایمر بهکار می‌رود. همچنین در برخی موارد در درمان بیش فعالی و نیز موارد دمانس مرتبط با پارکینسون مورد استفاده قرار می‌گیرد.

 

در این مطالعه برای تغلیظ و اندازه‌گیری مقادیر کم این دارو در نمونه‌های بیولوژیک ادرار و پلاسما، ترکیبی از روش میکرواستخراج سه فازی مایع با نوار حلال و اندازه‌گیری با کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(HPLC)، به کار گرفته شد که بسیار موفقیت‌آمیز بود.