1-5-6 بیمارى شبه بروسلوز………………………………………………………………….

 

        1-5-7 بروسلوز ناشى از تلقیح واكسن حیوانى………………………………………..

 

1-6 انتقال بیماری………………………………………………………………………………………….

 

1-7 پاسخ های ایمنی میزبان به بروسلا…………………………………………………………….

 

1-8 روشهای تشخیص…………………………………………………………………………………..

 

1-9 درمان بیماری ………………………………………………………………………………………..

 

1-10 واکسیناسیون…………………………………………………………………………………………

 

1-10-1 تولید پروتئین نوترکیب  Omp31…………………………………………….

 

1-10-2 استفاده از NPAP…………………………………………………………………..

 

1-10-3 استفاده از بروسلا ملیتنسیس سویه WR201……………………………………..

 

1-10-4 استفاده ازپروتئینهای غشاءداخلی16و19(Omp16&Omp19)بروسلاآبورتوس

 

1-10-5 تولید سویه زنده تخفیف حدت یافته با جهش بر روی ژنهایmanBA ،virB2 و asp24  در هر دو سویه بروسلا آبورتوس و بروسلا ملیتنسیس  

 

1-10-6 جهش بر روی ژنهای دخیل در سنتز LPS………………………………………….

 

1-10-7 استفاده از LPS خالص شده بروسلا ملیتنسیس……………………………………

 

1-10-8 استفاده از پروتئین CP24…………………………………………………………………

 

1-10-9 نتیجه گیری در مورد بهترین حالت ممکن واکسن انسانی بروسلا ملیتنسیس…

 

1-10-10 مجوز استفاده از واکسن بروسلا   ابورتوس سویه RB51 برای استفاده در گاوها…

 

1-11 دیواره سلولی باکتری های گرم منفی……………………………………………………….

 

        1-11-1 اندوتوکسین …………………………………………………………………………..

 

        1-11-2 ساختمان LPS ………………………………………………………………………

 

        1-11-3  عملکرد LPS………………………………………………………………………..

 

        1-11-4 تاثیرات LPS………………………………………………………………………….

 

1-12نایسریا………………………………………………………………………………………………….

 

       1-12-1 پورین های مننگوکوک………………………………………………………….

 

       1-12-2  PorA…………………………………………………………………………………..

 

فصل دوم: (سابقه وپیشینه تحقیق)

 

فصل سوم: (مواد و روشها)

 

3-1 وسایل مورد استفاده ……………………………………………………………………………….

 

3-2 مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………

 

3-3 روش کار ……………………………………………………………………………………………..

 

3-4 رنگ آمیزی گرم …………………………………………………………………………………….

 

3-5 طرز تهیه استوک ………………………………………………………………………………

 

3-6 روش استخراج DNA پلاسمیدی …………………………………………………………..

 

      3-6-1 طرز تهیه محلولهای مورد نیاز برای استخراج پلاسمید…………………….

 

      3-6-2 مراحل استخراج DNA پلاسمیدی……………………………………………….

 

3-7 الکتروفورز …………………………………………………………………………………………..

 

      3-7-1 طرز تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………

 

      3-7-2طرز تهیه بافرTBE(1X)…………………………………………………………….

 

3-8  بررسی بیان پروتئین……………………………………………………………………………..

 

3-9  نحوه آماده سازی جایگاه ژل…………………………………………………………………

 

3-10 روش تهیه بافر متراکم کننده…………………………………………………………….

 

3-11 روش تهیه بافر جداکننده ……………………………………………………………….

 

3-12 روش تهیه بافر تانک……………………………………………………………………..

 

3-13 آماده سازی الکتروفورز عمودی……………………………………………………………

 

       3-13-1 آماده سازی پروتئین ………………………………………………………………

 

       3-13-2 بارگذاری پروتئین………………………………………………………………….

 

3-14 رنگ آمیزی ژل.SDS-PAGE…………………………………………………………..

 

        3-14-1 ساخت محلول رنگ………………………………………………………………

 

        3-14-2 نحوه رنگ آمیزی…………………………………………………………………..

 

3-15 خالص سازی پروتئین نوترکیب E.coli………………………………………………..

 

3-16 شکستن سلولها برای آزادسازی پروتئین………………………………………………..

 

3-17 خالص سازی با ستون نیکل سفارز……………………………………………………….

 

        3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی………………………..

 

 

3-18 بردفورد……………………………………………………………………………………………

 

        3-18-1 تهیه معرف بردفورد…………………………………………………………..

 

3-19 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………………….

 

          3-19-1 پروتکل جدا سازی LPS……………………………………………………

 

          3-19-2 تهیه محلول دیالیز یا بافرفسفات…………………………………………..

 

3-20 سنجش غلضت  LPS بروسلا ملیتنسیس……………………………………………..

 

         3-20-1 تهیه LPS منحنی استاندارد………………………………………………….

 

3-21 روش کونژوگاسیون LPS با  PorA…………………………………………………..

 

3-22 خالص سازی کونژوگاسیون………………………………………………………………..

 

 

 

فصل چهارم:(نتایج )

 

4-1 احیا باکتری نوترکیب PorA……………………………………………………………….

 

4-2 استخراج DNA پلاسمیدی ……………………………………………………………….

 

4-3 بررسی بیان پروتئین …………………………………………………………………………..

 

4-4 خالص سازی پروتئین نوترکیب PorA………………………………………………..

 

4-5 بردفورد…………………………………………………………………………………………….

 

4-6 جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………………

 

4-7 سنجش غلظت LPS بروسلا ملیتنسیس………………………………………………

 

4-8 کونژوگاسیون LPS باPorA………………………………………………………………

 

فصل پنجم: (بحث)…………………………………………………………………………………..

 

نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………….

 

منابع و ماخذ …………………………………………………………………………………………..

 

 فهرست جدول ها

 

جدول1-1 طبقه بندی بروسلا……………………………………………………………………………………………

 

جدول 1-2 مقایسه بیماری زایی گونه های مهم بروسلا……………………………………………………….

 

جدول1-3 فراوانی شکایات بیماران مبتلا به بروسلوز بستری…………………………………………………

 

جدول1-4 فراوانی بعضی از یافته های بروسلوز طی چند فقره مطالعه…………………………………….

 

جدول 3-1 بافر جدا کننده 12%…………………………………………………………………………………………

 

جدول3-2 بافر متراکم کننده 6%…………………………………………………………………………………………

 

جدول3-3 بافر تانک………………………………………………………………………………………………………..

 

جدول3-4 تهیه معرف بردفورد………………………………………………………………………………………….

 

جدول3-5 تهیه معرف مورد استفاده در سنجشLPS…………………………………………………………..

 

 

 

فهرست شکل ها

 

شکل1-1 انواع سلولهایی که توسط باکتری بروسلا آبورتوس در میزبان طبیعی و در میزبان تصادفی درگیر میشوند…………………………………………………………………………………………………………………….

 

شکل1-2 شکل فرضی از تعاملات باکتری بروسلا آبورتوس با ماکروفاژ……………………………………

 

شکل 3-1 الکتروفورز با ژل پلی اکریل آمید…………………………………………………………………………..

 

شکل 4-1 کشت پارویی……………………………………………………………………………………………………..

 

شکل 4-2 DNA  پلاسمیدی……………………………………………………………………………………………..

 

شکل4-3SDS-PAGE,PorA ………………………………………………………………………………………..

 

شکل 4-4 باند خالص سازی شده PorA……………………………………………………………………………..

 

شکل 4-5 معادله منحنی استاندارد برای سنجش غلضت پروتئین خالص سازی شده PorA………..

 

شکل4-6 باندهای LPSبروسلا ملیتنسیس…………………………………………………………………………….

 

شکل 4-7 معادله منحنی استاندارد سنجشLPS…………………………………………………………………..

 

چکیده

 

بروسلوز یکی از پنج بیماری عفونی مشترک بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتری های جنس بروسلا به وجود می آید . بروسلاها ، باکتری های کوچک ، غیر متحرک ، گرم منفی کوکوباسیل و درون سلولی اختیاری که در طیف وسیعی از حیوانات ایجاد بیماری می کنند . بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس عمده ترین گونه های عامل بروسلوز انسانی هستند. واکسنهای بروسلوز حیوانی شامل باکتریهای غیر فعال شده و یا سویه های زنده تخفیف حدت یافته دو مشکل اساسی در انسان ایجاد می کنند: نخست آنکه گاهی ایجاد بیماری مینمایند و دوم آنکه با واکنشهای ازدیاد حساسیت ناخواسته همراه اند. در همین راستا در سالهای اخیر ایمنی زایی با آنتی ژنهای مختلفی از گونه های بروسلا به شکل مونووالان طبیعی کونژوگه و یا نوترکیب مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.از بین عوامل ویرولانس این ارگانیسم ،لیپوپولی ساکارید(LPS) بعنوان عامل ویرولانس اصلی شناخته شده است و سویه های جهش یافته و فاقد این جزء از دیواره سلولی، فاقد ویرولانس و توان بقای درون سلولی هستند.همچنین LPS به لحاظ ایمونولوژیک آنتی ژن اصلی سطح سلولی بروسلا محسوب میشود. به همین دلیل امروزه استفاده از LPS بروسلا به دلیل داشتن خواص آنتی ژنیک و ایمونوژنیک قوی جهت طراحی و تولید یک واکسن موثر انسانی بسیار مورد ارزیابی و مطالعه قرار میگیرد.امروزه پژوهش های متعددی در زمینه واکسن های زیر واحدی مونووالانت و یا کونژوگه ،با جایگزینی اجزاء دیگر باکتری از جمله پروتئین های غشاء خارجی جهت ایجاد پاسخ های ایمنی وابسته به لنفوسیتTصورت گرفته است  وزیکول غشاء خارجی مننگوکوک(OMV) متشکل از پروتئینهای کلاس 1 تا 4،فسفولیپید پلی ساکارید کپسولی و لیپواولیگوساکارید میباشد،این ماکرومولکول در خلال سیر رشد باکتری در بدن میزبان رها میشود و پژوهش ها نشان میدهد که نقش عمده ای را در القائ ایمنی حفاظت بخش پس از ابتلا به بیماری دارد.از مهمترین اجزائ این ماکرومولکول میتوان به PorA،از خانواده کلاس1 پروتئین غشائ خارجی اشاره نمود که توانایی ایجاد پاسخ های باکتریسیدی را دارد.  علاوه بر این وجود سایر ترکیبات از جمله لیپوالیگوساکارید و فسفولیپیدها،دارای خاصیت آدجوانتی بوده و پاسخ حفاظتی مناسبی را در انسان ایجاد مینمایند.

 

در این مطالعه ویال لیوفلیزه، حاوی porA ای که داخل E.coli کلون شده بود احیا گردید سپس برای اطمینان از اینکه porA روی پلاسمید باکتری کلون شده است استخراج DNA پلاسمیدی   انجام شد.در مرحله ی بعد بیان پروتئین porA انجام گردید و برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین ، با روش SDS-PAGE بررسی شد. برای بیشترین بیان ،خالص سازی پروتئین با ستون کروماتوگرافی (نیکل – سفاروز) انجام گردید وسپس با انجام بردفورد غلظت پروتئین  بدست آمد.در مرحله ی بعد LPS بروسلا ملیتنسیس جداسازی گردید و برای بررسی کیفیت و کمیت آن با روش SDS-PAGE بررسی شد وسپس با انجام ازمایش غلظت LPS بدست آورده شد.در نهایت LPS بروسلا ملیتنسیس  با porA نیسریا کونژوگه گردید.

 

بیشترین بیان پروتئین porA  در ساعت چهارم و پنجم در محدوده ی باند 65KD مشاهده شد . پس از خالص سازی پروتئین یک باند تک در محدوده ی 65KD مشاهده گردید و با انجام بردفورد غلظت پروتئین porA ،5 میکروگرم بر میلی لیتر بدست آمد.رویSDS-PAGE باندهای LPS  مشاهده شد .با انجام ازمایش غلظت LPS ،  97/3میکروگرم برمیلی لیتر بدست آمد.

 

کلمات کلیدی:لیپوپلی ساکارید ، بروسلا ملیتنسیس، نیسریا مننژیتیدیس، وزیکول غشای خارجی (OMV) ،porA

 

فصل اول

 

مقدمه

 

 1-1-طبقه بندی بروسلا:

 

بروسلاها جزء آلفا پرتئوباکتریا هستند و از نظر فیلوژنیک با باکتریهای پاتوژن و همزیست  (از جمله ریزوبیوم و آگرباگتریوم) گیاهان ، پارازیت های داخل سلولی جانوران ( از جمله بارتونلا و ریکتزیا) و فرصت طلب ها و آزادزیها مانند اوکراباکتریوم و کلوباکتر مرتبط می باشند .(کلاسن وهمکاران،1996؛ مورنو و همکاران ،2002 ؛ پریسنت و همکاران،2002 )

 

جنس بروسلا بر اساس تفاوت آنتی ژنتیک ، میزبان اصلی ، کشت باکتری در محیط ها و شرایط فیزیکوشیمیایی مختلف ، واکنش با آنتی سرمهای اختصاصی و تشابه DNA به هفت گونه تقسیم می گردد ، خصوصیات کلی این گونه ها در جدول( 1-1) آمده است . تاکنون 7 بیووار در بروسلا آبورتوس ، 3 بیووار در بروسلا ملی تنسیس و 5 بیوار در بروسلا سویس را مشخص نموده اند . در سایر گونه ها تاکنون بیووار خاصی شناخته نشده است (مورنو و همکاران،2002 ؛یانگ،1995؛جاوتز و همکاران،1998؛کو و همکاران،2003)  

 

جدول 1-1: طبقه بندی بروسلا

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-5-5 ) ریخت شناسی و شناسایی کاندیدا : 13

 

1-5-6 ) ایمنی در مقابل کاندیدا : 14

 

1-5-7 ) كاندیدیازیس : 14

 

1-5-7-1 ) عفونتهای ایجاد شده در اثر گونه های کاندیدا : 17

 

1-5-7-2 ) کاندیدا آلبیکنس : 18

 

1-6 ) ولوواژینیت كاندیدائی : 19

 

1-6-1 ) علایم ولوواژینال : 20

 

1-6-2 ) مراحل بیماری زایی کاندیدا : 21

 

1-6-3 ) عوامل مربوط به پاتوژن : 22

 

1-6-4 ) عوامل مربوط به میزبان : 23

 

1-6-5 ) ایمنی در ولوواژینیت كاندیدیایی : 27

 

1-6-6 ) تشخیص  RVVC : 28

 

1-6-7 ) درمان : 28

 

1-6-8 ) عوامل مؤثر بر روی درمان : 28

 

1-7 ) تعاریف اولیه ‌از شیمی ‌دارویی : 28

 

1-7-1 ) سیر تاریخی شیمی ‌دارویی : 29

 

1-7-2 ) تاریخ معرفی شیمی ‌دارویی به عنوان علم : 29

 

1-7-3 ) جنبه‌های بنیادی داروها : 29

 

1-7-4 ) کاربرد داروها : 30

 

1-8 ) داروهای ضد قارچی : 30

 

1-8-1 ) آزول ها : 31

 

1-8-2 ) آنتی بیوتیک های پلی اِن : 32

 

1-8-3 ) مقاومت گونه های مختلف کاندیدا علیه داروهای ضد قارچی : 32

 

1-8-4 ) مکانیسم های مقاومت در برابر عوامل ضد قارچی : 32

 

1-9 ) مکانیسم اثر فلوکونازول : 33

 

33

 

1-9-2 ) مکانیسم مقاومت کاندیدا علیه فلوکونازول : 34

 

1-9-3 ) نحوه استفاده از داروهای آزول : 34

 

3-1) اسامی تعدادی از مواد، وسایل و دستگاه های مورد استفاده: 42

 

3-1-1) مواد و محیط کشت های مورد ازمایش: 42

 

42

 

3-2) مواد و روش ها: 45

 

3-2-1) جمع آوری نمونه ها: 45

 

3-2-2) بررسی مستقیم میکروسکوپی: 45

 

3-2-3)کشت روی محیط: 46

 

تهیه محیط کشت سابورو دکستروز آگار: 46

 

3-2-4) تشخیص آزمایشگاهی گونه های کاندیدا : 47

 

3-2-4-1) بررسی پرگنه در محیط کروم آگارکاندیدا: 47

 

3-2-4-2) آزمایش ایجاد لوله زایا : 48

 

3-2-4-3)مورفولوژی و بررسی کلامیدوکونیدی بر روی کورن میل آگار( CMT80 ) : 48

 

3-2-4-4)بررسی ایجاد کلامیدوکونیدی در محیط کازئین اگار: 49

 

3-2-4-5) رشد در دمای 45 درجه سانتی گراد : 49

 

3-2-4-6) واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR  و RAPD : 50

 

3-2-5) تهیه سوسپانسیون سلول مخمری کاندیدا آلبیکنس: 54

 

3-2-6 ) روش میکرودیلوسین : 54

 

3-2-7 ) موارد کنترل مثبت و کنترل منفی آزمایشات : 55

 

3-2-8 ) انتقال میکروپلیت ها به گرم خانه ( گرم خانه گذاری ) : 55

 

3-2-9 ) کشت مجدد محتویات هر یک از حفرات میکروپلیت روی محیط سابورو دکستروز آگار حاوی کلرامفنیکل ( SC ) : 56

 

59

 

5-1 ) ارزیابی تعیین گونه های کاندیدا در مبتلایان به ولوواژینیت عود کنندکاندیدایی: 72

 

5-2 ) ارزیابی عملکرد ضد قارچی داروی فلوکونازول روی قارچ کاندیدا آلبیکنس : 74

 

منابع : 79

 

فهرست جداول

 

 

عنوان                                                                                                   صفحه

 

جدول 1- برخی از گونه های بیماریزای کاندیدا و نام مرحله جنسی آنها 16

 

جدول2- مشخصات مورفولوژیک گونه های بیماریزای پر اهمیت کاندیدا 16

 

جدول- 3  مروری بر انواع عفونتهای کاندیدایی و عوامل مستعدکننده آنها 17

 

جدول 4-2 : تعداد و درصد عدم رشد قارچ ( کشندگی ) کاندیدا آلبیکنس… 61

 

جدول 4-1 : نتایج فعالیت های مهار رشد  ( MIC90 ) و قارچ کشی ( MFC ) داروی فلوکونازول روی سویه های قارچ کاندیدا آلبیکنس… 60

 

جدول 4-3 : تعداد و درصد مهار رشد قارچ کاندیدا آلبیکنس… 61

 

جدول 4-4 : میانگین و انحراف معیار غلظت کشندگی قارچ کاندیدا آلبیکنس… 62

 

جدول 4-5 : میانگین و انحراف معیار مهار کنندگی قارچ کاندیدا آلبیکنس… 62

 

جدول 4-6 : میانگین و انحراف معیار سن در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدیایی. 62

 

جدول 4-7 : مقایسه گروه های سنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 63

 

جدول 4-8 : مقایسه تعداد دفعات زایمان در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 64

 

جدول 4-9 : بررسی وضعیت بارداری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 64

 

جدول 4-10 : بررسی شدت علائم بیماری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 65

 

جدول 4-11 : بررسی عوارض جسمی و روحی ناشی از ولوواژینیت کاندیدایی در مبتلایان  66

 

جدول 4-12 : بررسی سابقه استفاده از داروی فلوکونازول در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  67

 

جدول 4-13 : بررسی سابقه استفاده از داروهای ضد قارچی ( غیر از  فلوکونازول ) در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  68

 

جدول 4-14 : بررسی سابقه ابتلا به بیماری های خاص در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  68

 

جدول 4-15 : بررسی سابقه استفاده از دارو در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 69

 

جدول 4-16 : بررسی روش درمانی در موارد قبلی بیماری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  70

 

جدول 4-17 : بررسی وضعیت سیستم ایمنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 70

 

فهرست نمودارها

 

عنوان …………………………………………………………………………………………………………… صفحه

 

نمودار 4-1 : مقایسه درصدی گروه های سنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی. 63

 

نمودار 4-2 : مقایسه درصدی شدت علائم بیماری در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  66

 

نمودار 4-3 : مقایسه درصدی عوارض جسمی و روحی ناشی از ولوواژینیت کاندیدایی در مبتلایان  67

 

نمودار 4-5 : مقایسه درصدی وضعیت سیستم ایمنی در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  70

 

نمودار 4-4 : مقایسه درصدی سابقه استفاده از دارو در مبتلایان به ولوواژینیت کاندیدایی  69

 

فهرست شکل ها

 

عنوان                                                                                  صفحه

 

شکل3 -1: گرم خانه. 43

 

شکل3 -2 : اتوکلاو. 44

 

شکل3 – 3 : هود لامینار 44

 

شکل 3– 4 : میکروسکوپ نوری.. 44

 

شکل3 – 5 : کشت کاندیداروی محیط سابرو دکستروز آگار 46

 

شکل3- 6 : محیط سابرودکستروز آگار ( قبل از کشت قارچ ) 46

 

شکل 3– 7 : وجود كاندیدا آلبیكنس در محیط كروم آگار 48

 

شکل3- 8 :  مرحله ورتکس در استخراج DNA.. 51

 

شکل3-  9 :  مراحل استخراج DNA.. 52

 

شکل3 – 12 : پر کردن حفره های میکروپلیت توسط سمپلر و سر سمپلر در روش میکرودیلوسین  55

 

   57

 

.. 57

 

57

 

59

 

… 59

 

 

 

چکیده

 

زمینه و هدف: میزان بروز ولوواژینیت کاندیدیایی عود کننده توسط گونه های کاندیدا روند رو به افزایشی را نشان می دهد. بر اساس مطالعات، بعضی از گونه های کاندیدا نسبت به داروهای ضد قارچی مثل فلوکونازول مقاومت نشان می دهند. بنابراین با جداسازی و شناسایی گونه های کاندیدای مسبب فرم عود کننده ولوواژینال و تعیین حساسیت آنها به داروی فلوکونازول می توان الگوی مناسبی از بیماران و مقاومت دارویی آنرا در منطقه جغرافیایی مورد پژوهش گزارش کرد.

 

روش کار: جدایه ی مخمری مورد آزمایش مستقیم، کشت و آزمایش های تکمیلی برای شناسایی گونه های مختلف کاندیدا از قبیل روش های مولکولی PCR RFLP ) ( و غیر مولکولی (سابرو دکستروز آگار، کروم آگار، تست لوله زایا) قرار گرفتند. سپس فلوکونازول بر روی هر کدام از نمونه ها به روش میکرودیلوسیون براث آزمایش شد و حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت قارچ کشی داروها اندازه گیری و حساسیت آنها تعیین شد.

 

2-1-7-2- قارچ Fusarium culmurum ……………………………………………………………………………………………. 13

 

2-1-7-3- قارچ Fusarium avenaceum……………………………………………………………………………………………   13

 

2-1-7-4- قارچFusarium equiseta      ……………………………………………………………………………………………. 14

 

2-1-7-5- قارچFusarium nivale                                                                                          15

 

2-2- میکروارگانیسم­های ریزوسفر                                                                         15

 

2-3- اندوفیت و کلونیزاسیون   ………………………………………………………………………………… 18

 

2-4- باکتری­های اندوفتیک و کاربرد آن­ها…………………………………………………………………….   21

 

2-4-1- افزایش تولید هورمون­های گیاهی…………………………………………………………………….   21

 

2-4-2- تثبیت بیولوژیکی نیتروژن………………………………………………………………………………   25

 

2-4-3- فیتوبیورمیدیشن…………………………………………………………………………………………..   28

 

2-4-4- انحلال فسفات……………………………………………………………………………………………   39

 

2-4-5- تولید سیدروفور……………………………………………………………………………………………. 41

 

2-4-6- تولید آنتی­بیوتیک و آنتی­بیوزیس………………………………………………………………………. 44

 

2-5- باکتری­های اندوفتیک و تولید آنزیم……………………………………………………………………….. 51

 

2-6- تنوع و جمعیت میکروارگانیسم­های یافت شده به­عنوان اندوفتیک………………………………….. 53

 

فصل سوم (مواد و روش­ها)

 

3-1- جداسازی و کشت باکتری اندوفتیک………………………………………………………………………. 59

 

3-1-1- مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم……………. 59

 

3-1-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………. 59

 

3-1-2-1- نمونه و نمونه­گیری…………………………………………………………………………………….. 59

 

3-1-2-2- کشت و شناسایی………………………………………………………………………………………. 60

 

3-2-شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک…………………………………………………………………….. 60

 

3-2-1-رنگ­آمیزی گرم…………………………………………………………………………………………….. 60

 

3-2-2- تست کاتالاز……………………………………………………………………………………………….. 61

 

3-2-3- تست سیتوکروم­اکسیداز………………………………………………………………………………….. 61

 

3-2-4- تست کوآگولاز…………………………………………………………………………………………….. 61

 

3-2-5- تست حرکت………………………………………………………………………………………………. 62

 

3-2-6- تست هیدرولیز­ژلاتین…………………………………………………………………………………….. 62

 

3-2-7- تست سیمون­سیترات……………………………………………………………………………………… 63

 

3-2-8- تستMR/VP…………………………………………………………………………………………………. 63

 

3-2-9- تست هیدرولیز­نشاسته……………………………………………………………………………………. 63

 

3-2-10- تست هیدرولیز­کازئین………………………………………………………………………………….. 64

 

3-3- شناسایی باکتری­های تولید­کننده ترکیبات ضد­قارچی به روش مولکولار…………………………… 64

 

3-3-1- مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراج DNA………………………………………………… 64

 

3-3-2- روش استخراج DNA ژنومی…………………………………………………………………………… 65

 

3-3-3- روش تهیه ژل آگارز یک درصد……………………………………………………………………….. 65

 

3-3-4- انجامPCR………………………………………………………………………………………………………….. 66

 

3-3-4-1- وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر……………… 66

 

فصل چهارم (نتایج و بحث)

 

4-1- جداسازی باکتری­های اندوفتیک از گیاه­گندم…………………………………………………………….. 67

 

4-2- شناسایی فنوتیپی باکتری­های اندوفتیک                                                               68

 

4-3- ارزیابی اثر آنتاگونیسمی باکتری­های اندوفتیک برعلیه قارچ­های بیوکنترلی و قارچ­های پاتوژن
 گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………. 70

 

4-4- بررسی فعالیت آنزیم β-1و4­گلوکاناز……………………………………………………………………. 76

 

4-4-1- مواد و وسایل لازم………………………………………………………………………………………… 76

 

4-4-2- روش تهیه محلول نمکی 1­مولار………………………………………………………………………. 76

 

4-4-3- ترکیبات محیط CMCآگار1%…………………………………………………………………………… 77

 

4-4-4 معرف آزمایش کنگورد…………………………………………………………………………………….. 77

 

4-4-5 کشت و بررسی……………………………………………………………………………………………… 77

 

4-5- نتایج مربوط به شناسایی مولکولی باکتری­ها……………………………………………………………… 77

 

4-5-1- آنالیز کیفی محصولات PCR…………………………………………………………………………… 78

 

4-5-2- نتایج تعیین توالی………………………………………………………………………………………….. 78

 

فصل پنجم (نتیجه­ گیری)

 

5-1. نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………… 92

 

5-2پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 98

 

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………. 99

 

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………. 109

 

فهرست جداول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان جدول                                                                                                          صفحه

جدول2-1. مشخصه­هایی از بیماری زنگ…………………………………………………………………………………………5

جدول2-2. مشخصه­هایی از بیماری سیاهک……………………………………………………………………………………..6

جدول2-3. انواع میکوتوکسین فوزاریومی……………………………………………………………………………………….12

جدول2-4. انواع ترشحات ریشه……………………………………………………………………………………………………18

جدول2-5. اندوفیتیک­های تثبیت­کننده نیتروژن………………………………………………………………………………..28

جدول2-6. میکروارگانیسم­های مولد اسید­آلی………………………………………………………………………………….32

جدول2-7. میکروارگانیسم­های مولد بیوسورفاکتانت………………………………………………………………………..33

جدول2-8. میکروارگانیسم­های مولد گلیکوپروتئین………………………………………………………………………….34

جدول2-9. میکروارگانیسم­های اکسید­کننده و احیاء­کننده…………………………………………………………………..35

جدول2-10. میکروارگانیسم­های دخیل در فیتوبیورمیدیشن……………………………………………………………….39

جدول2-11. میکروارگانیسم­های مولد سیدروفور…………………………………………………………………………….43

جدول2-12. اندوفیت­های مولد آنتی­بیوتیک و عملکرد آن­ها……………………………………………………………..50

جدول3-1. شرایطPCR……………………………………………………………………………………………………………….66

جدول3-2. چرخهPCR………………………………………………………………………………………………………………..66

جدول3-3. توالی پرایمرطراحی شده برای16S rRNA………………………………………………………………………66

جدول4-1. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………68

جدول4-2. اسامی قارچ­های مورد آزمون………………………………………………………………………………………..71

جدول4-3. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium moniliforme………………………………………………………..72

جدول4-4. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium graminearum……………………………………………………..72

جدول4-5. نتایج آنتاگونیسمی برعلیهFusarium oxysporum…………………………………………………………..72

جدول4-6. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Fusarium culmorum…………………………………………………………..72

جدول4-7. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma virida………………………………………………………………73

جدول4-8. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Tricoderma harizanum……………………………………………………….73

جدول4-9. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه.Tricoderma asperellum………………………………………………………73

جدول4-10. نتایج آنتاگونیسمی برعلیه Macrophomina phaseolina………………………………………………73

جدول4-11. ترکیبات محیط CMCآگار1%……………………………………………………………………………………..76

جدول4-12. نتایج Blast……………………………………………………………………………………………………………..79

 

 

 

فهرست شکل­ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان شکل                                                                                                          صفحه

شکل2-1. انواع زنگ­ها…………………………………………………………………………………………………………………6

شکل2-2. انواع سیاهک­ها……………………………………………………………………………………………………………..7

شکل2-3. بیماری پاخوره………………………………………………………………………………………………………………8

شکل2-4. بیماری سوختگی­زرد­برگ……………………………………………………………………………………………….8

شکل2-5. بیماری لکه­چشمی…………………………………………………………………………………………………………9

شکل2-6. بیماری ارگوت……………………………………………………………………………………………………………10

شکل2-7. بیماری جرب و پوسیدگی فوزاریومی…………………………………………………………………………….11

شکل2-8. ماکروکنیدی فوزاریوم­گرامیناروم…………………………………………………………………………………….13

شکل2-9. ماکروکنیدی فوزاریوم­کلموروم………………………………………………………………………………………13

شکل2-10. ماکروکنیدی فوزاریوم­اوناسئوم…………………………………………………………………………………….14

شکل2-11. ماکروکنیدی فوزاریوم­اکوئیست……………………………………………………………………………………14

شکل2-12. عملکرد PGPR………………………………………………………………………………………………………..17

شکل2-13. عملکردPGPB………………………………………………………………………………………………………….24

شکل2-14. متانوتروف­های اندوفتیک……………………………………………………………………………………………38

شکل2-15. متابولیت­های ثانویه اکتینوباکتر­ها…………………………………………………………………………………44

شکل2-16. کلونیزاسیون اندوفیت­ها……………………………………………………………………………………………..54

شکل3-1. کیت استخراج DNA شرکت سیناژن………………………………………………………………………………64

عنوان شکل                                                                                                          صفحه

شکل4-2. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 2g51 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه……………74

شکل4-3. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله 1g61 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه……………74

شکل4-4. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G13 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه…………….75

شکل4-5. تاثیر آنتاگونیسمی ایزوله G14 علیه برخی از سویه­های قارچی به روش کشت­دوگانه…………….76

شکل4-6. محصول PCR…………………………………………………………………………………………………………….78

شکل4-7. هم­تراز­سازی توالی نمونه 2g51………………………………………………………………………………….. 80

شکل4-8. سکانس­ژنی16srRNA نمونه 2g51……………………………………………………………………………….81

شکل4-9. هم­تراز­سازی توالی نمونه 1g61……………………………………………………………………………………83

شکل4-10. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه 1g61……………………………………………………………………………84

شکل4-11. هم­تراز­سازی توالی نمونه G13…………………………………………………………………………………..86

شکل4-12. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G13……………………………………………………………………………..87

شکل4-13. هم­تراز­سازی توالی نمونه G14.…………………………………………………………………………………..89

شکل4-14. سکانس­ژنی 16srRNA نمونه G14……………………………………………………………………………..90

 

 

 

1-1 آنزیم ال-آسپاراژیناز

 

 

4

 

 

 

1-2   میکرو ارگانیسم‌های تولید کننده‌

 

 

6

 

 

 

1-3   مکانیسم تنظیم‌کننده ترشح آنزیم آسپاراژیناز

 

 

10

 

 

 

1-4  کلاس‌های عمومی از ال-آسپاراژیناز

 

 

11

 

 

 

1-5  روش تعیین سختی و ساختار ال-آسپاراژیناز

 

 

12

 

 

 

1-6 ویژگی‌های ساختاری ال-آسپاراژیناز

 

 

12

 

 

 

1-6-1ساختار مونومری آنزیم ال-آسپاراژیناز

 

 

12

 

 

 

1-6-1-1 شرح جایگاه فعال ال-آسپاراژیناز

 

 

14

 

 

 

1-6-2 ساختار تترامر آنزیم ال-آسپاراژیناز

 

 

15

 

 

 

1-6-3 ساختار اُکتامر آنزیم ال-آسپاراژیناز

 

 

17

 

 

 

1-7 انواع آنزیم ال-آسپاراژیناز برحسب منشأ جداسازی

 

 

18

 

 

 

1-7-1-آنزیم‌های بومی

 

 

18

 

 

 

1-7-1-1  ال-آسپاراژینازی از اشرشیا کلی

 

 

18

 

 

 

1-7-1-2 ال-آسپاراژینازی از اروینیا

 

 

19

 

 

 

1-7-2 آنزیم اصلاح‌شدهPEG)  -آسپاراژیناز)

 

 

20

 

 

 

 

1-8  کاربرد ال – آسپاراژینازها

 

 

22

 

 

 

1-8- 1  مکانیسم عمل به‌عنوان یک کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی

 

 

23

 

 

 

1-8-2  مکانیسم عمل به‌عنوان یک دارو

 

 

25

 

 

 

1-9 علم شیمی و فارماکولوژی برای دارو

 

 

26

 

 

 

1-10 نیمه‌عمر دارو

 

 

26

 

 

 

1-11 مسائل و رویکردهای مرتبط با استفاده درمانی از ال-آسپاراژیناز

 

 

27

 

 

 

1-11-1 عوارض ایمونولوژیک

 

 

27

 

 

 

1-11-2 مقاومت در برابر آسپاراژیناز

 

 

27

 

 

 

1-11-3 سمیت دارو

 

 

28

 

 

 

1-12 فارموکینیتیک

 

 

29

 

 

 

فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام‌شده

 

 

 

 

 

 

2_1 تحقیقات انجام‌شده در ایران و خارج از ایران

 

 

32

 

 

 

2-1-1 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های خاکزی مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز

 

 

32

 

 

 

2-1-2 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز به منظور بهینه سازی

 

 

34

 

 

 

2-1-3 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از محیط کشت اختصاصی M₉

 

 

37

 

 

 

2-1-4 تحقیقات انجام شد بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز با استفاده از روش نسلریزاسیون

 

 

38

 

 

 

2-1-5 تحقیقات انجام شده بر روی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز جدا شده ار آب و رسوبات

 

 

39

 

 

 

2-1-6 تحقیقات انجام شده بر روی آنزیم ال-آسپاراژیناز بر اساس روش  SDS-PAGE

 

 

39

 

 

 

فصل سوم: مواد و روش‌ها

 

 

 

 

 

 

3-1 غربالگری سویه‌های مولد آنزیم از خاک

 

 

42

 

 

 

3-2   جداسازی و کشت باکتری

 

 

42

 

 

 

3-2-1   مواد و وسایل لازم جهت جداسازی و کشت باکتری از خاک

 

 

42

 

 

 

3-2-2   کشت

 

 

43

 

 

 

3-3   فعالیت آنزیم

 

 

45

 

 

 

3-4 روش‌های اندازه‌گیری آمونیاك

 

 

45

 

 

 

3-5    مواد و وسایل لازم بررسی فعالیت آنزیم

 

 

45

 

 

 

3-6    معرف آزمایش

 

 

46

 

 

 

3-7 خواندن جذب لوله‌های Test و Blank

 

 

46

 

 

 

3-8 مراحل کلونینگ

 

 

47

 

 

 

3-9  شرح مراحل کلونینگ

 

 

48

 

 

 

فصل چهارم: نتایج

 

 

 

 

 

 

4-1   نتایج مربوط به جداسازی

 

 

60

 

 

 

4-1-1   نتایج کشت

 

 

60

 

 

 

4-1-2   نتایج رنگ‌آمیزی گرم و تست‌های بیوشیمیایی

 

 

61

 

 

 

4-1-3   نتایج بررسی فعالیت آنزیمی

 

 

63

 

 

 

4-1-4 نتیجه آنالیز کیفی قطعه تکثیر یافته

 

 

66

 

 

 

4-1-5  نتایج مربوط به مستعد سازی

 

 

66

 

 

 

4-1-6 نتایج مربوط به کشت ماتریکس

 

 

66

 

 

 

4-1-7 نتایج تست Quick- check

 

 

67

 

 

 

4-1-8 نتایج استخراج پلازمید

 

 

68

 

 

 

4-1-9 نتایج PCR تاییدی

 

 

69

 

 

 

4-1-10  نتایج تعیین توالی نمونه   : Bacillus cereus strain

 

 

69

 

 

 

4-1-11  نتایج تعیین توالی نمونه  : Bacillus thuringiensis strain

 

 

74

 

 

 

4-1-12  نتایج تعیین توالی نمونه  : Oerskovia turbata

 

 

79

 

 

 

فصل 5  نتایج

 

 

 

 

 

 

5-1 نتیجه

 

 

83

 

 

 

5-2 جمع بندی

 

 

83

 

 

 

5-3 محدودیت ها

 

 

83

 

 

 

5-4 پیشنهادها

 

 

84

 

 

 

منابع

 

 

85

 

 

 

 

فهرست جداول

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول ‏1-1 تعدادی از میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آسپاراژیناز	7
جدول1-2 منابع میکروبی ال-آسپاراژیناز و خواص آن	8
جدول1-3 مشخصات ال-آسپاراژیناز نشان‌دهنده فعالیت گلوتامیناز	19
جدول1-4 خواص آنزیم‌های اشرشیا کلی و اروینیا و برخی از فرآورده‌های بومی و اصلاح‌شده	20
جدول1-5 مقایسه‌ای از سمیت ال-آسپاراژیناز بومی و PEG	29
جدول1-6. خواص برخی از ال-آسپاراژینازهای میکروبی	31
جدول 3-1 مواد لازم جهت ساخت محیط کشت	42
جدول 3-2 مقادیر مورد نیاز برای تهییه میکس PCR با در نظر گرفتن + n	51
جدول 3-3   شرایط دمایی و زمانی مورد نیاز برای میکروتیوپ ها	51
جدول 3-4 مقادیر اضافه شده به داخل میکروتیوپ 0/2 cc	54
جدول 3-5 : میزان مواد اضافه شده به داخل میکروتیوپ در مرحله ی Quick-check	57
جدول4-1  قطر هاله تشکیل‌شده توسط سویه‌ها روی محیط  برحسب میلی‌متر	61
جدول4-2 رنگ‌آمیزی گرم نمونه‌های آنزیم مثبت	62
جدول4-3 نتایج مربوط به آزمودن‌های بیوشیمیایی نمونه‌های آنزیم مثبت	63
جدول4-4 جذب  نمونه های مولد آنزیم در طول‌موج 600 نانومتر	64
جدول4-5  جذب نمونه‌های مولد آنزیم در طول‌موج 480 نانومتر	72
جدول4-6  نتایج در سطح جنس و گونه	80

 

 

 

فهرست نمودار ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1-1 طبقه‌بندی عمومی ازآسپاراژیناز	11
نمودار 4 – 1 میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 600 تاتومتر	64
نمودار 4- 2  میزان جذب نمونه های مولد آنزیم ال آسپاراژیناز در 480 تاتومتر	65

 

 

 

فهرست شکل‌ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1  ساختار ال- آسپاراژیناز	3
شکل ‏1- 2 ساختار سه‌بعدی یک آنزیم آسپاراژیناز تولیدشده توسط Yersinia pestis(شناسه PBD: 3NTX )	6
شکل ‏1-3 شرح تصویری یک مدل مورفینی	11
شکل 1-4  هم‌ترازی بین ال-آسپاراژیناز	13
شکل1-5 توپولوژی از ال-آسپاراژیناز	14
شکل1-6  تصویرسازی از زیر واحد A آنزیم	14
شکل1-7  این کاریکاتور تشکیل دایمر بین مونومر A , C	15
شکل1-8 باقی‌مانده سایت فعال و اسیدآسپارتیک (لیگاند)	15
شکل1-9  اثرات متقابل در a , b با توجه به ارتباطات نزدیک در دایمر	16
شکل1-10  ساختار تترامر ال-آسپاراژیناز	17
شکل1-11 شکل نواری از آنزیم	17
شکل ‏1-12 واکنش میلارد. شاخه Z در اسیدآمینه آسپاراژین، CH2CONH2	25
شکل ‏1-13نقش کاتالیزوری آنزیم آسپاراژیناز در شکستن آسپاراژین	25
شکل1-14  مکانیسم عمل ال-آسپاراژیناز(نارتا و همکاران 2007)	26
شکل3-1 محیط  MMYبراث	44
شکل3-2 لوله‌های آماده‌شده جهت اسپکتروفتومتری	46
شکل4-1 تغییر رنگ محیط کشت بر اثر تولید آنزیم	61
شکل4-2مشاهده میکروسکوپی باکتری‌ها	62
شکل4-3 محصول PCR مورد تائید برای کلونینگ	66
شکل4- 4 رشد باکتری حاوی پلازمید نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار	66
شکل4-5 گسترش باکتری نوترکیب روی محیط آمپی سیلین دار جدید	67
شکل4 -6 کشت باکتری نوترکیب در LB برای PEX	67
شکل4 – 7 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% –    8 R	67
شکل4 – 8 ران کردن پلازمید نوترکیب از پلیت ماتریکس روی ژل1% – 5 R	68
شکل4-9  پلازمید نوترکیب استخراج شده برروی ژل 1%	68
شکل4-10 تکثیر قطعه هدف از روی پلازمید نوترکیب استخراجی	69
شکل 4-11  هم تراز سازی توالی نمونه  5 R	71
شکل 4-12 هم تراز سازی توالی نمونه ی  8 R	77

 

 

 

 

چکیده فارسی

 

آنزیم آسپاراژیناز به‌طور عمده در پزشکی برای درمان لوسمی لنفوبلاستی حاد[1]  و در صنایع غذایی برای کاهش تولید اکریل‌آمید در مواد غذایی نشاسته داری که سرخ یا برشته می‌شوند کاربرد دارد. ازآنجاکه ال- آسپاراژیناز[2]  جداشده از باکتری‌های مختلف دارای اثرات ضد سرطانی متفاوتی بوده است، جستجو برای یافتن میکروارگانیسم‌های تولیدکننده این آنزیم، یکی از راه‌های اصلی جهت دستیابی به آنزیمی با خصوصیات درمانی ایده آل می‌باشد. هدف این تحقیق جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های تولیدکننده ال-آسپاراژیناز از خاک‌ بوده است. نمونه‌های خاک از منابع مختلف نظیر جنگل، مزرعه، باغچه گرفته‌شده و پس از تهیه سوسپانسیون روی محیط کشت کشت داده شدند. کلنی‌های تولیدکننده‌ی آنزیم ال-آسپاراژیناز ، بر اساس تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی متمایز گردیدند. میزان فعالیت آن بر اساس روش نسلر موردبررسی قرار گرفت. باکتری‌های‌ تولیدکننده آنزیم دارای فعالیت مطلوب، پس از شناسایی بیوشیمیایی با روش مولکولی PCR مورد شناسایی قرار گرفتند و ‌توالی rRNA S 16نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج بدست آمده ،  بهترین و بیشترین میزان تولید آنزیم توسط باکتری های باسیلوس تورنجسیس و باسیلوس سرئوس و Oerskovia turbata  می باشد. بنابراین مطالعه حاضر نشان داد نمونه های خاک حاوی باکتری های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز می باشد.

1-8- روشهای تشخیص ……………………………………………………………………………………………………………………..20

 

1-9- درمان ………………………………………………………………………………………………………………………………………21

 

1-10- عوارض داروهای ضد سل ……………………………………………………………………………………………………….22

 

1-11- پیشگیری ………………………………………………………………………………………………………………………………..22

 

1_11 _1_ پیشگیری در جامعه ……………………………………………………………………………………………………………23

 

1_11_2_ پیشگیری با واکسن سل………………………………………………………………………………………………………..23

 

1-12- اهمیت مبارزه صحیح با سل ……………………………………………………………………………………………………..23

 

1-13- سل گاوی……………………………………………………………………………………………………………………………….24

 

1-13-1-بیماری سل در گاو ……………………………………………………………………………………………………………….24

 

1-13-2-علائم بالینی سل گاوی…………………………………………………………………………………………………………..26

 

1-13-3-تشخیص بیماری سل در گاو …………………………………………………………………………………………………27

 

1-13-4-کنترل بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………..27

 

1_14_ راههای ابتلا به سل گاوی ………………………………………………………………………………………………………..29

 

1-15- تعیین هویت مایکوباکتریومها ……………………………………………………………………………………………………30

 

1_15_1_تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات فنوتیپیک ………………………………………………….30

 

1- 15 -2- تعیین هویت مایکوباکتریومها بر اساس خصوصیات ژنوتیپی………………………………………………….35

 

1-15-2-1-تشخیص بیماری ……………………………………………………………………………………………………………..36

 

1-15-2-2- تعیین هویت مولکولی مایکوباکتری هاجهت تعیین گونه ……………………………………………………..39

 

1-15-2-2-1-پروب های اسید نوکلئیک ……………………………………………………………………………………………..39

 

1-15-2-2-2 ریبوتایپینگ ………………………………………………………………………………………………………………….39

 

1-15-2-2-3- روش هیبریدیزاسیونDNA – DNA ……………………………………………………………………………39

 

1-15-2-2-4-پروب های هیبریداسیون داخل ژنومی تجاری …………………………………………………………………40

 

1-15-3-ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس ………………………………………………………………………………40

 

1-16-تکنیک های ژنومی …………………………………………………………………………………………………………………..42

 

1 _16_1_تكنیك‌های ژنومی كه اساس آنها PCR نمی‌باشد …………………………………………………………………..42

 

1_16_1_2_انگشت‌نگاری DNA  به روش RFLP …………………………………………………………………………….43

 

1_16_2_1_اسپولیگوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………50

 

1_16_1_2_5_استفاده از مخلوط پروب‌ها در RFLP………………………………………………………………………..  50

 

1_16_2_2_ VNTR ……………………………………………………………………………………………………………………….51

 

فصل دوم (مروری بر تحقیقات انجام شده) …………………………………………………………………………………………55

 

2-1-تاریخچه بیماری سل ………………………………………………………………………………………………………………….56

 

2-2-وضعیت بیماری سل در جهان ……………………………………………………………………………………………………..58

 

2-3-تاریخچه سل گاوی در ایران ……………………………………………………………………………………………………….65

 

فصل سوم (مراحل روش تحقیق) ………………………………………………………………………………………………………70

 

3-1-جمع آوری نمونه ها …………………………………………………………………………………………………………………..71

 

3-2-مواد و تجهیزات مورد نیاز……………………………………………………………………………………………………………71

 

3_2_1_ مواد مصرفی…………………………………………………………………………………………………………………………71

 

3_2_2_تجهیزات مورد نیاز ………………………………………………………………………………………………………………..73

 

3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA…………………………………………………………………………….73

 

3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR…………………………………………………………………………………………………………73

 

3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی………………………………………………………………………………………………74

 

3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ……………………………………………………………………..74

 

3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون………………………………………………………………………………………………………74

 

3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی………………………………………………………………………………………………………74

 

3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ………………………………………………………………………………………74

 

موارد روش تحقیق …………………………………………………………………………………………………………………………….74

 

3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونه و رنگ آمیزی……………………………………………………………………………..74

 

3_4_1_3_تفسیر نتایج گسترش…………………………………………………………………………………………………………..76

 

3_4_ 2_کشت نمونه ها……………………………………………………………………………………………………………………..76

 

3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونه ها ………………………………………………………………………………………………….76

 

3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون ……………………………………………………………………………………..76

 

3_4_2_3_سانتریفیوژ و خنثی سازی PH……………………………………………………………………………………… 78

 

3_4_2_4_ کشت در لوله های لونشتاین – جانسون حاوی گلیسیرین و پیرووات……………………………….79

 

 

3_4_3_بررسی کشت لوله های لونشتاین – جانسون  ………………………………………………………………………80

 

3_4_4_  رنگ آمیزی به روش فلئورو کروم …………………………………………………………………………………. 80

 

3_4_5_ انجام تست های بیوشیمیایی تعیین هویت ………………………………………………………………………….81

 

3_4_5_1_تست نیاسین ……………………………………………………………………………………………………………….82

 

3_4_5_2_ تست کاتالاز ……………………………………………………………………………………………………………. 82

 

3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتاین – جانسون…………………………………………………………………………….82

 

3_4_7_استخراجDNA ………………………………………………………………………………………………………………..83

 

3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA……………………………………………………………… 83

 

3_4_7_2_ كنترل و جمع آوری سلولهای باكتری رشد یافته ……………………………………………………………..83

 

3_4_7_3_مراحل استخراج DNA ………………………………………………………………………………………………..84

 

3_4_8_ارزیابی كیفیت و کمیتDNAاستخراج شده………………………………………………………………………….86

 

3_4_8_1_ارزیابی كفیت DNA استخراج شده………………………………………………………………………………..86

 

3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی  جهت  ارزیابی کیفی DNA استخراج شده…………………………….86

 

بافر تریس-بورات-EDTA یک برابر……………………………………………………………………………………………….86

 

بافر نمونه………………………………………………………………………………………………………………………………………86

 

ژل آگارز……………………………………………………………………………………………………………………………………….86

 

3_4_8_2_ارزیابی کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP……………………………………… 88

 

3_4_8_3_ PCR بر اساس پروتکل WHO………………………………………………………………………………….. 90

 

3-4-8-3-1مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده………………………………………………………..91

 

3-4-9- الكتروفورز محصولPCR……………………………………………………………………………………………….. 92

 

RFLP …………………………………………………………………………………………………………………………………………92

 

3_4_10_هضم DNA  کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II………………………………………………………………. 93

 

3_4_11_جداسازی قطعاتDNA به وسیله الکتروفورز……………………………………………………………………..94

 

3_4_12_ ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………94

 

3_4_12_1_آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ …………………………………………………………94

 

3_4_12_2_عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………..96

 

3_4_12_3_بلاتینگ به روش موئینه ……………………………………………………………………………………………….96

 

3_4_12_3_عمل آوری غشا بعد از بلاتینگ ……………………………………………………………………………………97

 

3_4_13_تثبیت DNA برروی غشا ………………………………………………………………………………………………..98

 

3_4_14_تهیه پروب های هیبریداسیون و مک هیبریداسیون …………………………………………………………………..98

 

3_4_14_1_پروب PGRS ………………………………………………………………………………………………………………..99

 

3_4_14_2_به دست آوردن رقت مناسب برای پروبPGRS  به روش مک هیبریداسیون………………………..99

 

3_4_15_شناسایی ……………………………………………………………………………………………………………………………100

 

3_4_16_دات بلاتینگ ……………………………………………………………………………………………………………………..101

 

3_4_17_پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشان دار با دیگوکسیژنین ……………………………………..102

 

3_4_17_1_مرحله پری هیبریداسیون ………………………………………………………………………………………………..102

 

3-4-17-2- مرحله هیبیریداسیون ………………………………………………………………………………………………………102

 

فصل چهارم(نتایج و بحث ) …………………………………………………………………………………………………………….104

 

نتایج و بحث ……………………………………………………………………………………………………………………………………105

 

4-1- نمونه برداری ………………………………………………………………………………………………………………………….105

 

4-2- بررسی كشت لوله های لونشتاین– جانسون ………………………………………………………………………………..105

 

4-3-آزمون وجود IS6110 ………………………………………………………………………………………………………………106

 

4-3-1- نتایج واكنش PCR……………………………………………………………………………………………………………. 106

 

4-4- بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی ((RFLP…………………………………………………..107

 

4-5- بررسیDNA استخراج شده ……………………………………………………………………………………………………..108

 

4-6- نتایج هضم آنزیمی(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس……………………………………………………….109

 

4-7- نتایج ساترن بلاتینگ ………………………………………………………………………………………………………………..110

 

فصل پنجم(نتیجه گیری و پیشنهادات) ……………………………………………………………………………………………….114

 

پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………………………………….125

 

منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..126

 

منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………………………………………126

 

منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………127

 

 

 

فهرست جدول ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان جدول                                                                                                              صفحه

جدول1–1نامگذاری مایکوباکتریوم ها …………………………………………………………………………………………………….  8

جدول1-2:لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­های مختلف کندرشد مایکوباکتریای …………….  33

جدول 1- 3: لیست جدید تستهای رایج شیمیائی برای تمایز گونه­های مختلف سریع الرشد مایکوباکتریایی …..……………  35

جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقده­های لنفاوی گاو ارسالی به موسسه سرم سازی رازی ………………………………..  71

جدول 3-2: لیست مواد مصرفی ……………………………………………………………………………………………………………  72

جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون …………………………………………………………………  79

جدول 3-4:  تست­های تعیین هویت مایکوباکتریوم­ها ………………………………………………………………………………. 81

جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر …………………………………………………………………………………..  91

جدول 4-1- نمونه­های مورد استفاده به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونه­ها …………………………..  113

 

 

 

فهرست شکل ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ی نوشته‌ها

tbody>