1-4- شمارش، جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 13
1-5- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 15
1-6- پی سی آر (PCR). 15
1-6-1- تاریخچه. 16
1-6-2- اساس و روش کار. 18
1-6-3- مراحل PCR.. 19
1-6-4- پارامترهای مؤثر در PCR.. 20
1-7- مدل سازی.. 21
1-8- فرضیات پژوهش…. 25
1-9- اهداف پژوهش…. 25
فصل دوم
2-1- شناسایی باکتری های اسید استیک با استفاده از روش های مدرن.. 27
2-2- تولید سرکه زردآلو با استفاده از Acetobacter جدا شده از زردآلوی ایرانی.. 34
2-3- تولید سرکه آناناس و بررسی تاثیر متقابل بین مخمر و باکتری اسید استیکی.. 34
2-4- جداسازی و شناسایی نژاد Acetobacter از گیلاس سفید- قرمز ایرانی به عنوان نژادی با قابلیت تولید اسید بالا در تولید سرکه 36
2-5- بهینه سازی عوامل موثر در فرآیند تولید سرکه با استفاده از تخمیر موز. 36
2-6- روش های مدل سازی میکروبی.. 37
فصل سوم
3-1-زمان و مکان تحقیق.. 42
3-2- مواد مصرفی.. 42
3-2-1- خارک خرمای هلیله ای.. 42
3-2-2- سرکه خرما 42
3-2-3- مواد شیمیایی.. 43
3-2-4- مواد ژنتیکی.. 43
3-3- تجهیزات… 44
3-4- اندازه گیری ترکیبات خارک خرما 45
3-4-1- اندازه گیری قند. 45
3-4-2- اندازه گیری فیبر. 46
3-4-3- اندازه گیری فسفر. 46
3-4-4- اندازه گیری کلسیم. 47
3-4-5- اندازه گیری پتاسیم. 48
3-4-6- اندازه گیری رطوبت.. 48
3-4-7- اندازه گیری خاکستر. 49
3-4-8- اندازه گیری پروتئین.. 49
3-4- مرحله جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی و شناسایی آن ها 50
3-4-1- روش کشت.. 50
3-4-2- خالص سازی باکتری های استیکی.. 51
3-4-2-1- نگهداری جدایه های باکتری های اسید استیک…. 52
3-5-آزمون های تاییدی باکتری های استیکی.. 52
3-5-1-آزمون کاتالاز. 52
3-5-2- آزمون گرم. 53
3-6- استخراج DNA از جدایه های باکتریایی.. 54
3-7- انجام PCR و تکثیر ناحیه s rDNA16. 55
3-7-1- واکنش PCR. 55
3-7-2- تعیین توالی و مقایسه توالی ها 56
3-8- مرحله تولید الکل با استفاده از مخمر. 57
3-8-1-تهیه سوسپانسیون مخمر. 57
3-9- مرحله تهیه سرکه از محلول الکلی تهیه شده از تخمیر الکلی.. 59
3-9-1- انتخاب ایزوله های باکتری اسید استیک… 59
3-9-2- تهیه سوسپانسیون باکتری ها 59
3-10- آزمون های میکروبی و شیمیایی سرکه. 61
3-10-1- آزمون میکروبی.. 61
3-10-2- آزمون اندازه گیری pH.. 61
3-10-3- آزمون اسیدیته. 62
3-10-4- آزمون مواد جامد محلول. 62
3-10-5- آزمون اندازه گیری الکل. 62
3-11- مدل سازی.. 64
3-12- روش آماری تحلیلی داده ها 64
فصل چهارم
4-1- اندازه گیری ترکیبات خارک… 66
4-2- جداسازی وشناسایی فلور اسید استیکی نمونه های سرکه. 67
4-2-1- بررسی خصوصیات ظاهری پرگنه ها 67
4-2-2- آزمون های ابتدایی شناسایی (تایید اسید استیک باکتریایی بودن جدایه ها) 67
4-2-3- شناسایی جدایه ها در سطح جنس و گونه. 68
4-3- انتخاب جدایه های باکتری اسید استیک…. 70
4-3- تکنولوژی تولید سرکه. 73
4-3-1- آزمون های میکروبی.. 73
4-3-1-1- تغییرات رشد سلولی مخمر Saccharomyces cerevisiae. 73
4-3-1-2- تغییرات رشد سلولی باکتری های اسید استیکی.. 77
4-3-2- آزمون های شیمیایی.. 82
4-3-2-1-تغییرات pH نمونه های سرکه. 82
4-3-2-2-تغییرات اسیدیته نمونه های سرکه. 86
4-3-2-3- تغییرات مواد جامد محلول نمونه های سرکه. 90
4-3-2-4-تغییرات الکل نمونه های سرکه. 92
4-4- مدل سازی.. 97
4-4-1- مدل سازی رشد میکروبی.. 97
4-4-2- مدل سازی عوامل موثر بر تخمیر. 100
فصل پنجم
5-1- نتیجه گیری.. 111
5-2- پیشنهادات… 114
منابع.. 115
پیوست… 127
جدول 1-1- واکنش مخمرها طی فرآیند تخمیر الکلی.. 5
جدول 1-2- ترکیبات تشکیل دهنده خرما 8
جدول 1-3- طبقه بندی دوازده جنس خانواده Acetobacteriacea. 11
جدول 1-4- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی.. 16
جدول 1- 5- مدل های پیشبینی رشد میکروبی.. 23
جدول 2-1- شناسایی جدایه های باکتری اسید استیکی طی اسیدیفیکاسیون سرکه توسط تکنیک های متفاوت 29
جدول2-2- مدل های آزمایشی برای تخمیر سرکه آناناس با استفاده از yeast-S. cerevisiae M30 و AAB-A. aceti WK.. 34
جدول 3-1- لیست مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش…. 41
جدول 3-2- لیست مواد ژنتیکی مورد استفاده در این پژوهش…. 42
جدول 3-3- لیست تجهیزات مورد استفاده در این پژوهش…. 42
جدول 3-4- میزان مواد استفاده شده در واکنش PCR.. 55
جدول3-5- مراحل انجام واکنش PCR.. 56
جدول 3-6- نحوه تیماربندی جهت افزودن سوسپانسیون های مخمر و باکتری.. 61
جدول 4-1- ترکیبات اصلی خارک خرما رقم “هلیله ای”. 67
جدول 4-2 جدایه های مورد استفاده در واکنش PCR.. 69
جدول 4-3- مقایسه میزان اسیدیته و pH 30 جدایه اسید استیکی.. 71
جدول 4-4- مقایسه میزان رشد، مصرف الکل، اسیدیته و pH 12 جدایه اسید استیکی.. 72
جدول 4-5- نتایج حاصل از توالی یابی جدایه ها 73
جدول 4-6- مقایسه میانگین شمارش مخمر در طول 15 روز نگهداری.. 75
جدول 4-7- مدل سازی رشد مخمر طی تخمیر الکلی سرکه خارک خرما 98
جدول 4-8- مدل سازی رشد باکتری های اسید استیکی طی تخمیر استیکی سرکه خارک خرما 99
جدول 4-9- مدل های ارائه شده برای تغییرات بریکس با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 104
جدول 4-10- مدل های ارائه شده برای تغییرات pH با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 105
جدول 4-11- مدل های ارائه شده برای تغییرات اسیدیته با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 106
جدول 4-12- مدل های ارائه شده برای تغییرات الکل با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از 20، 30 و 40 درصد خارک خرما 107
جدول 4- 13- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات بریکس…. 108
جدول 4- 14- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات pH.. 108
جدول 4- 15- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات اسیدیته. 109
جدول 4- 16- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات الکل.. 109
شکل 3-1- روش کشت سطحی.. 51
شکل 3-2- مراحل جداسازی جدایه های باکتریایی.. 53
شکل 3-3- مرحله تخمیر الکلی تولید سرکه خارک خرما 58
شکل 3-4- مرحله اسیدیفیکاسیون تولید سرکه خارک خرما 60
شکل 3-5- اندازه گیری الکل نمونه ها 63
شکل 4-1- تصویر محصولات PCR در ژل الکتروفورز. 70
شکل 4-2- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 20 درصد خارک خرما طی 15 روز 79
شکل 4-3- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 30 درصد خارک خرما طی 15 روز 80
شکل 4-4- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر 40 درصد خارک خرما طی 15 روز 80
شکل 4-5- تغییرات pH در مرحله تخمیر الکلی.. 82
شکل 4-6- تغییرات pH در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 84
شکل 4-7- تغییرات اسیدیته در مرحله تخمیر الکلی.. 86
شکل 4-8- تغییرات اسیدیته در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 88
شکل 4-9- تغییرات مواد جامد محلول طی تخمیر الکلی و استیکی در غلظت 20 درصد خارک خرما طی 15 روز 90
شکل 4-10- تغییرات مواد جامد محلول با استفاده از جدایه های استیکی در غلظت 30 درصد خرما طی 15 روز 91
شکل 4-11- تغییرات مواد جامد محلول با استفاده از جدایه های استیکی در غلظت 40 درصد خرما طی 15 روز 91
شکل 4-12- تغییرات الکل در مرحله تخمیر الکلی.. 93
شکل 4-8- تغییرات الکل در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی.. 94
پیوست “الف”- مقایسه میانگین اثر جدایه در غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان مواد جامد محلول (TSS) 128
پیوست “ب”- مقایسه میانگین اثر جدایه در غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان pH.. 129
پیوست “ج”- مقایسه میانگین اثر جدایه در غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان اسیدیته. 130
پیوند “د”- مقایسه میانگین اثر جدایه در غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان الکل.. 131
پیوست “ه”- مقایسه میانگین شمارش باکتری های استیکی در طول 15 روز نگهداری.. 132
پیوست “و”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter pasteurianus در NCBI منطبق با توالی جدایه FR22 133
پیوست “ز”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR22 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 134
پیوست “ح”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter aceti در NCBI منطبق با توالی جدایه FR43 135
پیوست “ط”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR43 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 136
پیوست “ی”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter tropicalis در NCBI منطبق با توالی جدایه FR61 137
پیوست “ک”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR61 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 138
فصل اول
مقدمه و کلیات
1- مقدمه
سرکه فرآوردهای است که از مواد مختلف قندی و نشاستهای از طریق تخمیر الکلی و استیکی تهیه میشود. سرکه میتواند از مواد خام مختلف و با روشهای متفاوت تولید گردد. در گذشته از سرکه بهعنوان نگهدارنده استفاده میشد بهطوری که یا بهصورت طبیعی در ماده غذایی تولید میگردید و یا به آن اضافه میشد تا از رشد میکروبی نامطلوب در ماده غذایی جلوگیری کرده و ویژگیهای حسی آن را حفظ نماید (دی اوری و همکاران، 2002). استیک اسید یک طعمدهنده و ترکیب ضدمیکروبی در سرکه میباشد. همچنین مطالعاتی در زمینه اهمیت اسید استیک بهعنوان یک افزودنی غذایی جهت کمک به فرآیندهای غذایی بهمنظور از بین بردن آلودگی قبل از توزیع و مصرف انجام گرفته است (مارشال و همکاران، 2000).