2-2- تاریخچه. 18

 

فصل سوم: روش شناسی.. 21

 

3-1- مواد و وسایل: 22

 

3-2- دستگاه ها: 24

 

3-3- محلول سازی: 25

 

3-3-1- آماده سازی محیط کشت: 25

 

3-3-2- محیط شکلات اگار: 26

 

3-3-3- آماده سازی ژل اگارز 1 درصد: 27

 

3-4- طراحی و روش اجرا: 27

 

3-4-1- جمع‏آوری نمونه: 27

 

3-5- کشت نمونه ها: 27

 

3-6- تست ‌های بیوشیمیایی: 28

 

3-7- رنگ آمیزی: 29

 

3-8- نگهداری ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا در شرایط کرایو در دمای -80ْ: 29

 

3-9- استخراج DNA.. 30

 

3-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن: 30

 

3-10- بررسی کیفیت و کمیت DNAاستخراج شده: 30

 

3-11- راه اندازی و انجام PCR: 31

 

3-12- واکنشPCR.. 32

 

3-13- الکتروفورز محصول PCR: 35

 

3-13-1- مواد و وسایل مورد نیاز: 35

 

3-13-2- نحوه تهیه ژل اگارز و انجام الکتروفورز: 35

 

3-14- تفسیر ژل الکتروفورز. 36

 

3-15- RFLP.. 36

 

3-15-1- استخراج باند اصلی از روی ژل اگارز. 37

 

3-15-2- بررسی غلظت محصولات تخلیص شده توسط دستگاه نانودراپ: 37

 

3-16- مواد و وسایل لازم برای RFLP: 37

 

3-16-1- روش انجام RFLP باآنزیمAlu1: 38

 

3-16-2- انجامRFLP باآنزیم محدودالاثر EcoR1: 38

 

3-17- تعیین توالی و پردازش داده ها: 38

 

3-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالی یابی قطعه تکثیر شده: 39

 

فصل چهارم: تجزیه و تحلیل داده ها 40

 

4-1- تعداد نمونه‏ها و ایزولاسیون: 41

 

4-2-تستهای بیوشیمیایی: 42

 

4-3-نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده: 42

 

4-4- PCRژن ompP2 ایزوله‌های بالینی هموفیلوس آنفلوانزا: 43

 

4-5- RFLP: 44

 

4-6: نتایج تعیین توالی (Sequencing) و ثبت توالی‌ها دردیتابیسGeneBank/EMBL: 45

 

4-7- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی نمونه ها: 46

 

4-7-1- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 3: 46

 

4-7-2. آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 5: 47

 

4-7-3- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 8: 48

 

4-7-4- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 35: 49

 

4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره 47: 50

 

4-7-5- آنالیز بازهای حاصل از تعیین توالی ایزوله بالینی شماره14: 51

 

4-8- بررسی میزان شباهت و تفاوت ایزوله‌های بالینی تهران: 52

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری.. 56

 

5-1- آنالیز RFLP از ایزوله‌های بالینی: 57

 

5-2. آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 3: 57

 

5-2-1آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 5: 58

 

5-2-2- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 8: 58

 

5-2-3- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 35: 59

 

5-2-4- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 14: 60

 

 

5-2-5- آنالیز و بررسی جهش‌های ایجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ایزوله شماره 47: 60

 

5-3- بحث: 61

 

پیشنهادات: 66

 

منابع. 67

 

فهرست منابع. 68

 

Abstract 75

 

پیوست ها 76

 

فهرست جداول

 

جدول3-1- مواد تشکیل دهنده و مقدار حجم آنها برای  PCRاز ompP2. 34

 

جدول 3-2- برنامه PCR برای تکثیر ژن ompP2. 34

 

جدول3-3- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای ompP2. 35

 

جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌های دریافتی از بیماران مورد مطالعه. 41

 

جدول 4-2 نتایج بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده 42

 

جدول 4-3- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 3 در NCBI 47

 

جدول 4-4- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 5 در NCBI 48

 

جدول 4-5- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 8 در NCBI 49

 

جدول 4-6- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 35 در NCBI 50

 

جدول 4-7- نتیجه Blast سکانس نوکلئوتیدی شماره 47 در NCBI 51

 

جدول 4-8-. نتیجهBlast سکانس اسید نوکئیک شماره 14 در NCBI 52

 

فهرست اشکال

 

شکل1-1- ساختارشیمیایی پلی ریبوزیل ریبیتول فسفا ت… 3

 

شکل1-3- کلو نی‌های هموفیلو س آنفولانزا روی محیط شکلات اگار. 5

 

شکل3-1-تست کاتالاز. 29

 

شکل 3-2- شکل باسیل گرم منفی هموفیلوس آنفلوانزا 30

 

شکل 3-3- دستگاه ترموسایکلر. 34

 

شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز. 36

 

شکل4-1- ژن ompP2 ایزوله‌های با لینی… 43

 

شکل 4-2و4-3- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر Alu1برای ژنompP2 ایزوله‌های بالینی… 44

 

شکل 4-4- جایگاه برش آنزیم محدودالاثر ECOR1برای ژن  ompP2ایزوله‌های بالینی… 44

 

شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2 نمونه شماره  14با پرایمر Forward.. 45

 

شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعیین توالی ژن ompP2نمونه شماره  14با پرایمر Revers. 45

 

شکل 4-7- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 46

 

شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 3.. 46

 

شکل 4-9- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 5  با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 47

 

شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 5.. 47

 

شکل 4-11- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسی توالی اسیدآمینه آنها 48

 

شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 8.. 48

 

شکل 4-13- آنالیز و مقایسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 49

 

شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئین شماره 35.. 49

 

شکل 4-15- آنالیزو مقایسه نمونه شماره  47با اطلاعات ثبت شده در  Gene Bankو بررسی توالی اسیدآمینه آنها 50