1-1-1 تاریخچه صرع…………………………………………………………………………………………………………….

 

 

1

 

 

 

        1-1-2 تعریف صرع………………………………………………………………………………………………………………

 

 

2

 

 

 

1-1-3 اپیدمولوژی صرع…………………………………………………………………………………………………………

 

 

3

 

 

 

        1-1-4 اتیولوژی صرع…………………………………………………………………………………………………………….

 

 

3

 

 

 

            1-1-4-1 علل قبل از زایمان…………………………………………………………………………………………………

 

 

3

 

 

 

            1-1-4-2 ضربه های مغزی………………………………………………………………………………………………….

 

 

4

 

 

 

            1-1-4-3 علل عفونی و بیماریها…………………………………………………………………………………………….

 

 

4

 

 

 

            1-1-4-4 علل متابولیکی……………………………………………………………………………………………………..

 

 

4

 

 

 

            1-1-4-5  سکته های مغزی…………………………………………………………………………………………………

 

 

5

 

 

 

            1-1-4-6  صرع و ژنتیک…………………………………………………………………………………………………….

 

 

5

 

 

 

      1-1-5 تشخیص بیماری……………………………………………………………………………………………………………

 

 

5

 

 

 

      1-1-6 درمان صرع………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

7

 

 

 

      1-1-7  فیزیوپاتولوژی صرع……………………………………………………………………………………………………….

 

 

9

 

 

 

      1-1-8  طبقه بندی صرع……………………………………………………………………………………………………………

 

 

12

 

 

 

            1-1-8-1 اجزاء تشنج…………………………………………………………………………………………………………

 

 

12

 

 

 

 

            1-1-8-2  طبقه بندی بین المللی صرع……………………………………………………………………………………..

 

 

12

 

 

 

                   1-1-8-2-1 تشنج های موضعی……………………………………………………………………………………..

 

 

12

 

 

 

                   1-1-8-2-2 تشنج های عمومی………………………………………………………………………………………

 

 

13

 

 

 

      1-1-9  صرع لوب گیجگاهی………………………………………………………………………………………………………

 

 

16

 

 

 

      1-1-10 نقش نئوکورتکس در مکانیسم صرع زایی……………………………………………………………………………..

 

 

16

 

 

 

      1-1-11 نقش صرع زایی نواحی لیمبیک…………………………………………………………………………………………

 

 

18

 

 

 

1-2 مدل های ایجاد صرع تجربی در حیوانات………………………………………………………………………………………..

 

 

20

 

 

 

       1-2-1 کیندلینگ…………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

21

 

 

 

       1-2-2 کیندلینگ شیمیایی…………………………………………………………………………………………………………

 

 

21

 

 

 

       1-2-3 انواع کیندلینگ شیمیایی…………………………………………………………………………………………………..

 

 

22

 

 

 

          1-2-3 -1 تزریق درون بطنی مواد تشنج زا………………………………………………………………………………….

 

 

22

 

 

 

          1-2-3 -2 تزریق سیستمیک مواد تشنج زا…………………………………………………………………………………..

 

 

22

 

 

 

1-3  استرس………………………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

23

 

 

 

       1-3-1 مفهوم استرس………………………………………………………………………………………………………………

 

 

23

 

 

 

       1-3-2 مراحل پاسخ دهی به استرس ……………………………………………………………………………………………

 

 

25

 

 

 

       1-3-3  پیامد های استرس…………………………………………………………………………………………………………

 

 

26

 

 

 

       1-3-4 نوروآناتومی و فیزیولوژی استرس ………………………………………………………………………………………

 

 

27

 

 

 

            1-3-4-1 سیستم سمپاتیک(SAM) ………………………………………………………………………………………..

 

 

28

 

 

 

            1-3-4-2 سیستم هیپوتالاموس- هیپوفیز- آدرنال(HPA) ………………………………………………………………

 

 

28

 

 

 

       1-3-5  تجارب اولیه مطالعات حیوانی نوروبیولوژی استرس…………………………………………………………………

 

 

32

 

 

 

1-4 اثرات استرس بر صرع……………………………………………………………………………………………………………….

 

 

32

 

 

 

فصل دوم –  روش تحقیق و مواد

 

 

34

 

 

 

1-2 نوع حیوان و نحوه تهیه: …………………………………………………………………………………………………………….

 

 

35

 

 

 

2-2 شرایط نگهداری موش ها : ………………………………………………………………………………………………………..

 

 

35

 

 

 

2-3 مواد و لوازم مورد نیاز : ……………………………………………………………………………………………………………

 

 

35

 

 

 

      2-3-1 مواد شیمیایی: ………………………………………………………………………………………………………………

 

 

35

 

 

 

      2-3-2 ابزار و وسایل ……………………………………………………………………………………………………………….

 

 

36

 

 

 

2-4 گروه های مورد آزمایش : ………………………………………………………………………………………………………….

 

 

36

 

 

 

      2-4-1 گروه بندی ماده ها: ………………………………………………………………………………………………………

 

 

37

 

 

 

      2-4-2 گروه های ماده و گروه بندی نوزادان نر : ………………………………………………………………………………

 

 

39

 

 

 

2-5 شاخص های مورد آزمایش: ……………………………………………………………………………………………………..

 

 

42

 

 

 

2-6 بررسی مراحل 6 گانه رفتار تشنجی ……………………………………………………………………………………………..

 

 

43

 

 

 

فصل سوم –  نتایج تحقیقات

 

 

44

 

 

 

3-1 استرس جدایی از مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی را در فرزندان افزایش می دهد……………………………..

 

 

45

 

 

 

3-2 استرس در سنین جوانی مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشتج زایی در فرزندان کاهش می دهد. ………………………

 

 

47

 

 

 

      3-2-1 استرس قبل از بارداری مادران…………………………………………………………………………………………………………….

 

 

47

 

 

 

      3-2-2 استرس حین بارداری مادران………………………………………………………………………………………………………………

 

 

47

 

 

 

      3-2-3 استرس در بارداری دوم مادران…………………………………………………………………………………………………………..

 

 

50

 

 

 

3-3: ماندگاری استرس در مادر، شدت تشنج فرزندان را پس از رسیدن به سن بلوغ افزایش می دهد……………………………

 

 

51

 

 

 

فصل چهارم – بحث و نتیجه گیری

 

 

53

 

 

 

4-1 مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

54

 

 

 

4-2 الف) استرس در سنین جوانی مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی در فرزندان را پس از رسیدن به بلوغ، کاهش می دهد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

55

 

 

 

4-3 ب) ماندگاری استرس در مادر، شدت تشنج فرزندان را پس از رسیدن به سن بلوغ افزایش می دهد. …………………….

 

 

57

 

 

 

4-4 ج)استرس جدایی از مادر، استعداد ابتلای به صرع و تشنج زایی را در فرزندان افزایش می دهد……………………………..

 

 

58

 

 

 

5-4 نتیجه گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

61

 

 

 

پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

 

 

62

 

 

 

منابع فارسی و انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

63

 

 

 

چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

72

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فهرست شکل ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

عنوان	صفحه
1-1 امواج EEGدر حملات تشنجی………………………………………………………………………………………………………………………	6
1-2 تخریب فیبر های رابط نیم کره های مغزی…………………………………………………………………………………………..	8
1-3 تحریک عصب واگ……………………………………………………………………………………………………………………………………..	9
1-4 مقایسه امواج EEGدر حالت طبیعی و تشنجات……………………………………………………………………………………………….	11
1-5 میسر انتشار تشنج در صرع موضعی و عمومی………………………………………………………………………………………………….	14
1-6 مراحل تونیک  و کلونیک……………………………………………………………………………………………………………………………..	14
1-7 تشنج ساده………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	15
1-8 طبقه بندی تشنج ها……………………………………………………………………………………………………………………………………..	16
1-9 محور HPA………………………………………………………………………………………………………………………………………………..	31
2-1 موش ماده و نوزادانش………………………………………………………………………………………………………………………………….	36
2-2 شنای اجباری موش……………………………………………………………………………………………………………………………………..	38
2-3 محدودیت حرکت موش(Restrain) ……………………………………………………………………………………………………………	38
2-4 علامت گذاری موش ها………………………………………………………………………………………………………………………………..	41
2-5 نوزادان نر ………………………………………………………………………………………………………………………………………………….	41
2-6 استرس جدایی از مادر نوزادان نر…………………………………………………………………………………………………………………..	40
2-7 بررسی و زمانگیری مراحل تشنج……………………………………………………………………………………………………………………	42
2-8 ثبت دقیق عمق و مراحل تشنج………………………………………………………………………………………………………………………	43
2-9 تزریق درون صفاقی (IP) …………………………………………………………………………………………………………………………….	43

 

فهرست نمودار ها و منحنی ها

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ی نوشته‌ها

1-5-2-1 ……… علائم بالینی سینوزیت مزمن.. 9

 

1-5-2-2 ……… تشخیص و درمان سینوزیت مزمن.. 9

 

1-6 ………………. عوارض سینوزیت… 9

 

1-7 ………………. مشخصات باکتری های مورد آزمایش…. 10

 

1-7-1 ………….. مشخصات کلی استرپتوکوک ها 10

 

1-7-1-1 ……… استرپتوکوک پیوژن. 11

 

1-7-1-1-1 ….. بیماری زایی.. 12

 

1-7-1-1-2 ….. تست های تشخیصی.. 12

 

1-7-1-1-3 ….. درمان. 13

 

1-7-1-2 ……… استرپتوکوک پنومونیه. 13

 

1-7-1-2-1 ….. تست های تشخیصی.. 14

 

1-7-1-2-2 ….. بیماری زایی.. 15

 

1-7-1-2-3 ….. درمان. 15

 

1-7-2 ………….. مشخصات کلی استافیلوکوک ها 16

 

1-7-2-1 ……… استافیلوکوک اورئوس… 16

 

1-7-2-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 17

 

1-7-2-1-2 ….. بیماری زایی.. 18

 

1-7-2-1-3 ….. درمان. 18

 

1-7-3 ………….. مشخصات کلی پسودوموناس ها 19

 

1-7-3-1 ……… پسودوموناس آئروژینوزا 19

 

1-7-3-1-1 ….. تست های تشخیصی.. 21

 

1-7-3-1-2 ….. بیماری زایی.. 21

 

1-7-3-1-3 ….. درمان. 21

 

1-8 ………………. تاریخچه درمانی گیاهان دارویی.. 22

 

1-8-1 ………….. ویژگی های خاص تولید گیاهان دارویی.. 23

 

1-8-2 ………….. شکل های مصرف گیاهان دارویی.. 23

 

1-9 ………………. ویژگی های گیاهان دارویی مورد آزمایش…. 23

 

1-9-1 ………….. گیاه درمنه. 23

 

1-9-1-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 24

 

1-9-1-2 ……… خواص درمانی.. 25

 

1-9-2 ………….. گیاه اسطو خودوس… 25

 

1-9-2-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 26

 

1-9-2-2 ……… خواص درمانی.. 26

 

1-9-3 ………….. گیاه دارچین.. 26

 

1-9-3-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 28

 

1-9-3-2 ……… خواص درمانی.. 29

 

1-9-4 ………….. گیاه مورد یا مورت… 29

 

1-9-4-1 ……… ترکیبات شیمیایی و اسانس گیاه 31

 

1-9-4-2 ……… خواص درمانی.. 32

 

1-10 ……………. اسانس های گیاهی.. 32

 

1-11 ……………. نانواسانس های گیاهی.. 33

 

1-11-1 ………… کیتوزان. 33

 

1-12 ……………. بررسی اثرات ضد میکروبی.. 35

 

1-13 ……………. تعیین MIC به روش میکرودایلوشن (ریز رقت) 35

 

1-13-1 ………… متغیر های مؤثر در انجام آزمون MIC.. 36

 

1-13-2 ………… تعیین MBC.. 36

 

1-13-3 ………… دیسک دیفیوژن. 36

 

1-13-3-1 ……. دینامیک تشکیل هاله. 37

 

1-13-3-2 ……. دیسک های آنتی بیوتیک… 37

 

1-13-4 ………… انتشار در آگار (چاهک) 37

 

1-14 ……………. روش های تهیه سوسپانسیون. 38

 

1-15 ……………. بیان مسئله. 38

 

1-16 ……………. ضرورت اهمیت موضوع. 39

 

 

1-17 ……………. اهداف تحقیق.. 40

 

1-17-1 ………… هدف کلی.. 40

 

1-17-2 ………… هدف اختصاصی.. 40

 

1-18 ……………. فرضیات تحقیق.. 40

 

1-19 ……………. سوالات تحقیق.. 40

 

2-1 ………………. سوابق تحقیق در ایران و سایر کشور ها در زمینه استفاده از اسانس ها و نانواسانس های گیاهی   43

 

3-1 ………………. دستگاه های مورد نیاز. 48

 

3-2 ………………. مواد و وسایل مورد نیاز. 48

 

3-2-1 ………….. سوش های میکروبی مورد مطالعه. 50

 

3-2-2 ………….. اسانس های مورد مطالعه. 50

 

3-3 ………………. روش کار. 51

 

3-3-1 ………….. روش تهیه نانواسانس های درمنه، اسطوخودوس، مورد و دارچین.. 51

 

3-3-1-1 ……… تهیه محلول کیتوزان. 51

 

3-3-2 ………….. روش تهیه محیط کشت اولیه برای رشد. 53

 

3-3-2-1 ……… محیط BHI 53

 

3-3-2-2 ……… محیط MHA.. 53

 

3-3-2-3 ……… محیط BA.. 53

 

3-3-3 ………….. فعال کردن باکتری ها و انتقال آن ها به محیط کشت… 54

 

3-3-4 ………….. روش تهیه محلول سوسپانسیون میکروبی.. 54

 

3-3-5 ………….. روش ساخت کدورت های استاندارد مک فارلند. 54

 

3-3-6 ………….. تعیین MIC با روش میکرودایلوشن.. 55

 

3-3-6-1 ……… روش علمی تعیین MIC.. 55

 

3-3-7 ………….. تعیین حداقل غلظت کشندگی باکتری یا MBC.. 57

 

3-3-8 ………….. روش انتشار در آگار (دیسک کاغذی) 57

 

3-3-8-1 ……… دیسک های آنتی بیوتیک مورد آزمایش (شاهد مثبت) 58

 

3-3-9 ………….. روش انتشار در آگار (چاهک) 58

 

4-1 ………………. شرح مختصری از مطالعه. 61

 

4-2 ………………. نتایج FTIR ترکیبات نانواسانس ها 61

 

4-3 ………………. نتایج حاصل از پراکندگی نور دینامیکی برای مطالعه اندازه نانوذرات… 63

 

4-4 ………………. نتایج microscope Scanning electron مربوط به اسانس های نانوکپسول شده 64

 

4-5 ………………. نتایج microscope Transmission electronمربوط به اسانس های نانو کپسول شده 65

 

4-6 ………………. نتایج آزمون تعیین حساسیت… 66

 

4-6-1-1 ……… نتایج MIC نانواسانس ها 68

 

4-6-1-2 ……… نتایج MIC اسانس ها 68

 

4-6-1-3 ……… نتایج MBC اسانس ها و نانواسانس ها 69

 

4-6-2 ………….. نتایج اثرات ضد میکروبی نانواسانس ها به روش انتشار دیسک و مقایسه با چند آنتی بیوتیک رایج   75

 

4-6-3 ………….. نتایج آزمایش انتشار در آگار(چاهک) 78

 

5-1 ………………. بحث.. 83

 

5-2 ………………. نتیجه گیری.. 89

 

5-3 ………………. پیشنهادات.. 89

 

. .. 90

 

چکیده لاتین..95

 

فهرست جداول

 

جدول 3-1       روش تهیه استاندارد لوله های مک فارلند. 55

 

جدول 4-1       نتایج آزمایش MIC و MBC نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد. 67

 

جدول 4-2       نتایج آزمایش MIC و MBC اسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد، دارچین بر حسب میکروگرم
بر میلی لیتر μg⁄ml 68

 

جدول 4-3       قطر هاله عدم رشد سویه های میکروبی مورد آزمایش در برابر تعدادی از دیسک های آنتی بیوتیکی متداول در آزمایش دیسک دیفیوژن 77

 

فهرست نمودارها

 

نمودار 4-1       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

 

نمودار 4-2       نمودار حداقل غلظت کشندگی ( MBC ) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پنومونیه. 71

 

نمودار 4-3       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

 

نمودار 4-4       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استرپتوکوک پیوژن. 72

 

نمودار 4-5       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

 

نمودار 4-6       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر استافیلوکوک اورئوس… 73

 

نمودار 4-7       نمودارحداقل غلظت بازدارندگی (MIC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

 

نمودار 4-8       نمودارحداقل غلظت کشندگی (MBC) اسانس ها و نانواسانس های اسطوخودوس، درمنه، مورد و دارچین در برابر پسودوموناس آئروژینوزا 74

 

فهرست شکل ها

 

شکل 1-1         سینوس های پارانازال اطراف بینی و صورت… 3

 

شکل 1-2         استرپتوکوک پیوژن رشد یافته در کشت خون. 11

 

شکل 1-3         رنگ آمیزی گرم از خلط که در آن استرپتوکوک پنومونیه. 13

 

شکل 1-4         رنگ آمیزی گرم استافیلوکوک اورئوس… 17

 

شکل 1-5         رنگ آمیزی گرم پسودوموناس آئروژینوزا 20

 

شکل 1-6         گیاه درمنه. 24

 

شکل 1-7         گیاه اسطوخودوس… 25

 

شکل 1-8         گیاه دارچین.. 28

 

شکل 1-9         چوب و پودر دارچین.. 28

 

شکل 1-10       گیاه مورد. 31

 

شکل 1-11       ساختار شیمیایی پلیمر کیتوزان. 34

 

شکل 1-12       ساختار مولکولی کیتین.. 35

 

شکل 3-1         اسانس های تهیه شده از شرکت باریج اسانس کاشان. 51

 

شکل 3-2         دستگاه اولترا سونی کیت در مرکز ژنتیک… 52

 

شکل 4-1         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب بیوپلی ساکاریدی کیتوزان. 62

 

شکل 4-2         نتایج طیف سنجی مادون قرمز حاصل از ترکیب اسید میرستیک… 62

 

شکل 4-3         نتایج حاصل از طیف سنجی مادون قرمز دو ترکیب کیتوزان و اسید میرستیک در کنار هم. 63

 

شکل 4-4         توزیع اندازه نانوذرات ترکیبات اسانس نانوکپسول شده با استفاده از دستگاه DLS. 64

 

شکل 4-5         تصویر ساختار نانوکپسول های کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

 

شکل 4-6         تصویر ساختار نانوکپسول کیتوزان حاوی اسانس توسط میکروسکوپ الکترونی.. 65

 

شکل 4-7         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 66

 

شکل 4-8         میکروپلیت بعد از انجام آزمایش MIC.. 67

 

شکل 4-9         پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس اسطوخودوس بر روی استرپتوکوک پیوژن بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

 

شکل 4-10       پلیت کشت داده شده مربوط به تأثیر نانواسانس دارچین بر روی استرپتوکوک پنومونیه بعد از آزمایش MIC بر روی محیط کشت بلاد آگار برای تعیین MBC.. 69

 

شکل 4-11       پلیت های کشت شده مربوط به تأثیر اسانس اسطوخودوس بر روی استافیلوکوک اورئوس بر روی محیط آگار برای تعیین MBC.. 70

 

شکل 4-12       پلیت های کشت داده شده مربوط به تأثیر اسانس مورد بر روی پسودوموناس آئروژینوزا بر روی محیط آگار برای تعیین MBC، رقت شماره 3 رقت MIC.. 70

 

شکل 4-13       پلیت های تلقیح شده با باکتری پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های کاغذی آغشته به غلظت های مختلف نانواسانس اسطوخودوس… 76

 

شکل 4-14       پلیت های تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های کاغذی آغشته با غلظت های مختلف نانواسانس دارچین.. 76

 

شکل 4-15       پلیت تلقیح شده با باکتری استافیلوکوک اورئوس حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 77

 

شکل 4-16       پلیت تلقیح شده با پسودوموناس آئروژینوزا حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

 

شکل 4-17       پلیت تلقیح شده با باکتری استرپتوکوک پیوژن حاوی دیسک های آنتی بیوتیکی.. 78

 

شکل 4-18       پلیت تلقیح شده با استافیلوکوک اورئوس. قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک ها به خوبی قابل مشاهده است   79

 

۱-۱۵ ژل پلاکتی.. 13

 

۱-۱۶ عصاره پلاکتی.. 14

 

۱-۱۷ تأثیرات عصاره پلاکتی روی ترمیم زخم. 14

 

۱-۱۸ فاکتورهای رشد و مسیر سیگنالینگ اختصاصی‌شان. 19

 

۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

 

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

 

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

 

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

 

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

 

27

 

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است: 28

 

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی.. 30

 

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

 

۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی.. 30

 

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

 

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

 

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها 33

 

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده. 33

 

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف.. 34

 

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

 

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 36

 

۲-۵ اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلولی به روش  assay Scratch. 36

 

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

 

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

 

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

 

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

 

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه‌های RNA.. 40

 

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ‌آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

 

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

 

۲-۷-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 43

 

۲-۷-7 پرایمر. 43

 

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

 

۲-۷-9 Real time PCR. 44

 

۲-۸ جمع‌آوری عصاره سلولی.. 46

 

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد. 46

 

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling  47

 

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

 

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

 

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها: 49

 

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

 

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

 

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

 

.. 53

 

۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست.. 54

 

۳-۲ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 56

 

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست    57

 

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر بیان ژن‌های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

 

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج‌شده. 62

 

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین‌های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

 

.. 72

 

4-1 بحث.. 73

 

4-2 نتیجه گیری.. 79

 

۴-3 پیشنهاد‌ها 80

 

 

. 81

 

منابع انگلیسی.. 82

 

فهرست جداول

 

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

 

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول‌های پلاکتی (۲۲) 11

 

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

 

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

 

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

 

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

 

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

 

فهرست اشکال

 

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

 

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

 

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

 

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

 

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

 

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

 

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل‌شده در استخراج RNA.. 38

 

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

 

شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روی ژل اگاروز. 41

 

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

 

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

 

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

 

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها 50

 

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت‌های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف در مقایسه با گروه‌های کنترل در ۲۴ ساعت    55

 

. 55

 

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه‌های دیگر به‌جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

 

. 58

 

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

 

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

 

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

 

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

 

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

 

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج‌شده در گروه‌های مختلف.. 63

 

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

 

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

 

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

 

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

 

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

 

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

 

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   67

 

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   68

 

شکل 3- 19: رنگ‌آمیزی ژل حاوی پروتئین‌ها 69

 

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

 

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

 

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

 

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

 

چکیده

 

هدف:

 

1-6)نقش مهندسی متابولیک در توسعه سویه‌های صنعتی…………………………………………………………… 18

 

1-7) متابولیت‌های میکروبی …………………………………………………………………………………………………. 21

 

1-8)تعریف و تاریخچه آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………….  24

 

1-9)گروه های میکروبی تولید آنتی بیوتیکها……………………………………………………………………………. 25

 

1-9-1)اکتینومایستها…………………………………………………………………………………………………………….. 26

 

1-9-1-1) باکتری Saccharopolyspora erythraea  ……………………………………………………………. 30

 

1-10)تقسیم‌بندی آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………………………………………………………………………. 31

 

1-10-1) طبقه‌بندی بر مبنای شباهت عمومی ساختار شیمیایی…………………………………………………… 31

 

1-10-1-1)ماکرولیدها ………………………………………………………………………………………………………… 33

 

1-10-2) طبقه‌بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………. 35

 

1-10-3)آنتی‌بیوتیک‌های بازدارنده سنتز پروتئین………………………………………………………………………..35

 

1-11)عوامل تعیین‌کننده حساسیت و مقاومت میکروارگانیسم ها به آنتی‌بیوتیک‌ها………………………… 36

 

1-12)انتخاب آنتی‌بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………………. 37

 

1-13)موارد کاربرد آنتی‌بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………. 38

 

1-14)اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………. 38

 

1-14-1)تاریخچه و منبع………………………………………………………………………………………………………. 38

 

1-14-2)ساختمان و ویژگی‌های اریترومایسین…………………………………………………………………………. 40

 

1-14-3)آنتی‌بیوتیک‌های مشتق‌شده از اریترومایسین…………………………………………………………………. 42

 

1-14-4)فعالیت ضد‌باکتریایی اریترومایسین…………………………………………………………………………….. 43

 

1-14-5)مکانیسم عمل اریترومایسین……………………………………………………………………………………… 44

 

1-14-6)کاربردهای اریترومایسین و مشتقات آن………………………………………………………………………. 45

 

1-14-7)موارد منع مصرف اریترومایسین………………………………………………………………………………… 48

 

1-14-8)عوارض جانبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………. 48

 

1-14-9) انواع در دسترس……………………………………………………………………………………………………. 49

 

1-15)میکروارگانیسم های صنعتی………………………………………………………………………………………….. 49

 

1-16)جداسازی و نگهداری میکروارگانیسم‌ها…………………………………………………………………………. 50

 

1-17)جداسازی میکروارگانیسم‌های مناسب از محیط……………………………………………………………….. 51

 

1-18)کلکسیون‌های کشت…………………………………………………………………………………………………….. 52

 

1-19)نگهداری میکروارگانیسم‌ها…………………………………………………………………………………………… 53

 

1-19-1)نگهداری در دمای پایین…………………………………………………………………………………………… 53

 

1-19-1-1) نگهداری روی محیط‌کشت شیب‌دار حاوی آگار…………………………………………………….. 53

 

1-19-1-2)نگهداری با استفاده از روش ژرف انجمادی……………………………………………………………. 54

 

1-19-1-3)نگهداری در نیتروژن مایع…………………………………………………………………………………….. 55

 

1-19-2)نگهداری در حالت بدون آب……………………………………………………………………………………. 55

 

1-19-2-1)نگهداری در خاک……………………………………………………………………………………………….. 56

 

1-19-2-2)نگهداری در سیلیکاژل…………………………………………………………………………………………. 56

 

1-19-2-3)نگهداری در سلولز……………………………………………………………………………………………… 57

 

1-19-2-4)نگهداری در آب مقطر…………………………………………………………………………………………. 57

 

1-19-2-5)نگهداری در روغن……………………………………………………………………………………………… 57

 

1-19-2-6) لیوفیلیزه کردن…………………………………………………………………………………………………… 58

 

1-20) محیط کشت تخمیر صنعتی…………………………………………………………………………………………. 59

 

1-21) نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها………………………………………………………………………………….. 61

 

1-21-1) کربن……………………………………………………………………………………………………………………. 62

 

1-21-1-1) عوامل موثر بر انتخاب منبع کربن…………………………………………………………………………. 62

 

1-21-2) نیتروژن   ……………………………………………………………………………………………………………. 63

 

1-21-3) هیدروژن و اکسیژن………………………………………………………………………………………………… 65

 

1-21-4) مواد معدنی…………………………………………………………………………………………………………… 65

 

1-22) تنظیم‌کننده‌های متابولیکی…………………………………………………………………………………………… .66

 

1-23) ضد کف‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 66

 

1-24) طراحی و فرمول‌بندی محیط کشت………………………………………………………………………………. 67

 

1-25) فرایند تخمیر تولید آنتی‌بیوتیک …………………………………………………………………………………….68

 

1-25-1) مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی‌بیوتیک …………………………………………………………68

 

1-25-2) بخش‌های اصلی فرآیند تخمیری……………………………………………………………………………… 68

 

 

1-25-3) تهیه مایع تلقیح و فرایند توسعه آن…………………………………………………………………………… 74

 

1-25-4) مرحله بذر (Seeding )………………………………………………………………………………………….. 77

 

1-25-5) مرحله نهایی (مرحله تولید)…………………………………………………………………………………….. 79

 

1-25-6) تکنولوژی تخمیر آنتی‌بیوتیک………………………………………………………………………………….. 82

 

1-25-6-1) تخمیر شیک فلاسک………………………………………………………………………………………….. 82

 

1-25-6-2) فرمانتورهای همزندار…………………………………………………………………………………………. 83

 

1-25-7) تاثیر دما بر فرایند تخمیر آنتی‌بیوتیک………………………………………………………………………… 84

 

1-25-7-1) انتقال حرارت و کنترل دما………………………………………………………………………………….. 86

 

1-25-8) تاثیر pH روی متابولیسم سلول………………………………………………………………………………….87

 

1-25-9) مرحله شناسایی و استخراج محصول………………………………………………………………………… 89

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………… 91

 

فصل سوم: مواد و روش‌ها

 

3-1) میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………………………………………………………….. 97

 

3-2) معرف‌های رنگی مورد استفاده ……………………………………………………………………………………… 97

 

3-3) مواد لازم برای سنجش غلظت اریترومایسین……………………………………………………………………. 97

 

3-3-1) تهیه بافر pH 9.6…………………………………………………………………………………………………….. 97

 

3-3-2) تهیه بافر pH 4.2…………………………………………………………………………………………………….. 98

 

3-3-3) تهیه کلرفرم اشباع از بافر pH 9.6 و بافر  pH 9.6اشباع از کلرفرم…………………………………. 98

 

3-3-4) تهیه محلول برمو فنل بلو…………………………………………………………………………………………… 99

 

3-4) محیطهای کشت اسپوریزاسیون……………………………………………………………………………………… 100

 

3-4-1) محیط اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………….. 100

 

3-4-1-1) باز کردن آمپول لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………. 103

 

3-4-2) آزمایش ها با محیط‌کشت صنعتی برای تولید اریتروماسین……………………………………………..103

 

3-4-2-1) مرحله بذر‌دهی (Seeding)………………………………………………………………………………….. 103

 

3-4-2-1-1)تعیین pH هر کدام از ارلن‌ها…………………………………………………………………………….. 105

 

3-4-2-1-2) تعیین وزن تر بیومس (PMW )……………………………………………………………………….. 105

 

3-4-2-1-3)بررسی محیط‌های کشت از لحاظ آلودگی ( Contamination test )……………………… 106

 

3-4-2-2) مرحله تخمیر……………………………………………………………………………………………………….108

 

3-5) میزان اوره اضافه شده به محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………109

 

3-5-1) اوره………………………………………………………………………………………………………………………..109

 

3-6) تجهیزات مورد استفاده در آزمایش ها …………………………………………………………………………….113

 

3-7) روش تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………………………………….113

 

3-8) روش سنجش غلظت اریترومایسین در نمونه های تخمیری………………………………………………..114

 

3-8-1) روش HPLC……………………………………………………………………………………………………………114

 

3-8-1-1) مقدمه ای بر کروماتوگرافی…………………………………………………………………………………….114

 

3-8-1-2) فاز ساکن و فاز متحرک…………………………………………………………………………………………118

 

3-8-1-3) اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام……………………………………………………………………….119

 

3-8-1-4) کاربردهای کیفی…………………………………………………………………………………………………..120

 

3-8-1-5) آنالیز کمی……………………………………………………………………………………………………………120

 

3-8-1-5-1) روش استاندارد خارجی(External Standard)……………………………………………………..120

 

3-8-1-5-2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition)………………………………………………….. 121

 

3-8-1-5-3) استاندارد داخلی(Internal Standard)…………………………………………………………………121

 

3-8-1-6) نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………….122

 

3-8-2) روش TLC (Thin Layer Chromatography )…………………………………………………………..122

 

3-8-2-1) سیر تحولی و رشد……………………………………………………………………………………………….122

 

3-8-2-2) کوماتوگرافی لایه نازک (TLC )…………………………………………………………………………….123

 

3-8-2-3) کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک……………………………………………………………………………..125

 

33-8-3) روش Spectrophotometric……………………………………………………………………………………126

 

3-8-3-1) با اسپکتروفوومتر آشنا شویم…………………………………………………………………………………..127

 

3-8-3-2) قانون بیر- لامبرت………………………………………………………………………………………………..128

 

3-8-3-3) استفاده از اسپکتروفوتومتر……………………………………………………………………………………..128

 

3-8-4) روش Bioassay………………………………………………………………………………………………………129

 

3-8-4-1) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………….131

 

3-8-4-2) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین……………………………………………131

 

3-8-4-2-1) محیط کشت مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………132

 

3-8-4-2-2) محیط کشت مولر هینتون براث………………………………………………………………………….132

 

3-8-4-3) تهیه مایه تلقیح…………………………………………………………………………………………………….133

 

3-8-4-4) ایجاد چاهک……………………………………………………………………………………………………….134

 

3-8-4-5) تهیه بافر فسفات با 8 = pH……………………………………………………………………………………134

 

3-8-4-6) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………….134

 

3-8-4-7) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها…………………………………………………………..135

 

3-8-4-8) اندازه گیری قطر هاله مهار شده……………………………………………………………………………..135

 

3-8-4-9) حذف و جایگزینی داده های گمراه کننده……………………………………………………………….136

 

3-8-4-10) رسم منحنی استاندارد…………………………………………………………………………………………136

 

3-8-5) استخراج اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..137

 

3-8-5-1)تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………………………………….137

 

3-8-5-2) تهیه رقت های مایع تخمیر……………………………………………………………………………………139

 

3-8-5-3) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر……………………………………………………………………..139

 

3-8-5-4) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین با برموفنل‌بلو…………………………………………………..140

 

3-8-5-5) اندازه‌گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل‌بلو……………………………140

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 ) بررسی اثر غلظت30 گرم‌درلیتر آرد‌سویا برروی پارامترهای مورد‌نظر در طی تخمیر……………..142

 

4-1-1 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا برروی pH محیط کشت تخمیر……………………….143

 

4-1-2 ) بررسی اثرغلظت30 گرم‌درلیترآردسویا برروی درصد وزن‌تر‌بیومس درمحیط تخمیر………….143

 

4-1-3 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا در میزان تولید اریترومایسین……………………………144

 

4-1-4)بررسی‌اثرغلظت30گرم‌درلیترآردسویابرروی‌مورفولوژی‌باکتری erythraea .S……………………..145

 

4-2)سنجش‌ومقایسه همزمان پارامترهای مورد بررسی درتمام غلظت‌ها درطی‌فرایند تخمیر……………148

 

4-2-1 ) سنجش و مقایسه pH در حالت‌های مختلف………………………………………………………………148

 

4-2-2 )سنجش و مقایسه درصد وزن تر بیومس تولید شده در حالت‌های مختلف……………………….149

 

4-2-3 )سنجش و مقایسه میزان اریترومایسین تولید شده در حالت‌های مختلف ………………………….150

 

4-2-4 ) تعیین غلظت بهینه اوره و سویا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………151

 

4-2-4-1)بررسی پارامترهای مختلف برای غلظت بهینه(40% اوره) در تولید اریترومایسین…………….151

 

4-2-4-1-1) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) در میزان تولید اریترومایسین………………………….. 151

 

4-2-4-1-2 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی pH محیط کشت ………………………………152

 

4-2-4-1-3 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی درصد وزن تر بیومس…………………………153

 

4-2-4-1-4 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی مورفولوژی باکتری…………………………….153

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادها

 

تاثیر ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک ها…………………………………….158

 

5-1) رابطه بین منابع نیتروژنی استفاده شده در محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین………………159

 

5-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی بر تولید اریترومایسین…160

 

5-2) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده و pH محیط کشت تخمیر…………………………………………162

 

5-3) رابطه بین رشد باکتری  Saccharopolyspora  erythraea و میزان تولید اریترومایسین………..163

 

5-4) رابطه بین میزان رشد باکتری  Saccharopolyspora  erythraea وتغییرات بیومس درطی فرایند تخمیر………………………………………………………………………………………………………………………………….165

 

5-4-1) سینتیک رشد میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….165

 

5-5)رابطه بین مورفولوژی سویه Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین…………….169

 

5-6) برآورد هزینه‌ها…………………………………………………………………………………………………………….171

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی سویا دریک bach صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………….172

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا در محیط تخمیر…………………………………………….172

 

5-6-1-2) استفاده از غلظت بهینه 40% اوره در محیط تخمیر…………………………………………………….173

 

5-7) پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………….175

 

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………………………………………..177

 

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………. 184

 

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………..185

 

عنوان                                           فهرست جداول                                             صفحه

 

جدول (1-1): راهنمای دوزاژ ماکرولیدهای خوراکی…………………………………………………………………..33

 

جدول (1-2): ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………………..40

 

جدول(1-3): نقش فیزیولوژیکی عناصر غذایی پرمقدار درون سلول و میزان متوسط مورد نیاز………….61

 

جدول(1-4 ): مهمترین منابع نیتروژن برای تولید تعدادی از متابولیت های ثانویه……………………………65

 

جدول(1-5): مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک…………………………………………………….72

 

جدول (1-6): محدوده بهینه دما برای گروه های باکتریایی………………………………………………………….85

 

جدول (3-1) : ترکیبات محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………….101

 

جدول(3 -2):  ترکیبات محلول میکروالمنت …………………………………………………………………………..101

 

جدول (3-3): ترکیبات محیط کشت بذردهی ………………………………………………………………………….104

 

جدول (3-4): محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………………………..108

 

جدول(3-5): خصوصیات اوره……………………………………………………………………………………………….111

 

جدول(3-6): آنالیز اوره…………………………………………………………………………………………………………112

 

جدول(3-7): غلظت‌های اریترومایسین در حجم‌های استاندارد اریترومایسین و حجم‌های مورد نیاز برای

 

تهیه آن‌ها……………………………………………………………………………………………………………………………..139

 

جدول ( 4-1 ) : غلظت‌های مختلف اوره و سویا استفاده شده در حالت‌های مختلف………………………148

 

عنوان                                            فهرست نمودارها                                         صفحه

 

نمودار ( 4-1): تغییرات pH در طی فرایندتولید اریترومایسین در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

 

نمودار(4-2): تغییرات درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در محیط حاوی 30گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

 

نمودار( 4-3) : میزان اریترومایسین تولید شده در روزهای مختلف تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….144

 

نمودار(4-4): تغییرات pH محیط کشت در طی فرایند تخمیر در غلظت‌های مختلف……………………..149

 

نمودار(4-5): درصد وزن تر بیومس تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر………………149

 

نمودار(4-6) : میزان اریترومایسین تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر…………………150

 

نمودار(4-7): میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر………………………151

 

نمودار(4-8): تغییرات  pH در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر…………………………………………..152

 

نمودار(4-9): درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره………………………………153

 

عنوان                                              فهرست اشکال                                       صفحه

 

شکل (3-1): روش تهیه کلروفرم اشباع از بافر و بافر اشباع از کلروفرم………………………………………….99

 

شکل (3-2): محیط اسپورزایی در روز چهارم انکوباسیون………………………………………………………….102

 

شکل (3-3): محیط اسپورزایی در روز چهاردهم انکوباسیون………………………………………………………102

 

شکل (3-4): فرمول شیمیایی و عکسی از اوره………………………………………………………………………….110

 

شکل (3-5): روش تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………….113

 

شکل ( 3-6): نمونه ای از سرسمپلر فیلتردار…………………………………………………………………………….113

 

شکل (3-7): نمایی از دستگاه HPLC……………………………………………………………………………………..119

 

شکل (3-8): نمونه ای از یک کروماتوگرام………………………………………………………………………………119

 

شکل (3-9): نمایی از روش TLC………………………………………………………………………………………….125

 

شکل (4-1): مورفولوژی میسلیوم ها در روز چهارم تخمیر………………………………………………………..145

 

شکل (4-2): مورفولوژی میسلیوم ها در روز ششم تخمیر………………………………………………………….146

 

شکل (4-3): مورفولوژی میسلیوم ها در روز هشتم تخمیر…………………………………………………………146

 

شکل (4-4): مورفولوژی میسلیوم ها در روز دهم تخمیر……………………………………………………………147

 

شکل (4-5): مورفولوژی میسلیوم ها در روز یازدهم تخمیر……………………………………………………….147

 

شکل(4-6): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره……………………………………………………………………………………………………………………154

 

شکل(4-7): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………..154

 

شکل(4-8): مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره………………………………………………………………………………………………………………..155

 

شکل(4-9): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………155

 

شکل(4-10): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………156

 

 

 

چکیده فارسی

 

صنعت بیوتکنولوژی دارویی یعنی بکارگیری میکروارگانیسم‌های مولد با هدف تولید یک محصول بیوسنتزیک مورد مصرف در درمان و دارو. میکروارگانیسم‌ها قادرند بسیاری از مواد و ترکیبات مهم صنعتی را که بسادگی از منابع دیگر قابل تهیه نیستند تولید کنند. از جمله ترکیبات تولید شده توسط میکروارگانیسم ها، متابولیت‌های ثانویه نظیر آنتی بیوتیک ها هستند. اریترومایسین یک آنتی‌بیوتیک ماکرولیدی است و اهمیت آن در این است که می‌تواند جایگزین پنی‌سیلین ها و تتراساکلین ها در بیمارانی باشد که به این داروها حساسیت مفرط دارند. بدست آوردن حداکثر میزان تولید اریترومایسین مستلزم وجود یک محیط کشت کاملاً متوازن است. تاکنون فنون زیادی برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه بکار رفته است، از جمله تغییر ترکیبات موجود در محیط کشت با منابع ارزانتر.تاکنون در مورداثر استفاده از منبع اوره بر روی رشد  erythraea   Saccharopolysporaو تولید اریترومایسین گزارشی نشده است.

 

 

 

 

4

 

 

1-1-2 کلزا و اهمیت اقتصادی آن……………………………………………………………………

 

 

 

5

 

 

1-2 تنش خشکی………………………………………………………………………………..

 

 

 

8

 

 

1-2-1 مکانیسم­های مقاومت به خشکی در گیاهان زراعی……………………………………………….

 

 

 

11

 

 

1-2-2 اثر تنش خشکی بر روی کلزا…………………………………………………………………

 

 

 

12

 

 

1-2-3- ﺗﺄثیر  تنش خشکی بر رشد و فتوسنتز………………………………………………………

 

 

 

14

 

 

1-2-4 اثر تنش خشکی روی آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و مالون­دی­آلدهید………………………………

 

 

 

18

 

 

1-2-5 ﺗﺄثیرتنش خشکی بر میزان نیترات و نیترات ردوکتاز…………………………………………….

 

 

 

19

 

 

1-2-6 ﺗﺄثیر  تنش خشکی بر القای اسمولیت­های سازگار………………………………………………

 

 

 

21

 

 

1-3 کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان…………………………….

 

 

 

21

 

 

1-3-1 اثر تنش­های محیطی در فرایند­های مولکولی در گیاهان………………………………………………………….

 

 

 

23

 

 

1-3-2 مسیرهای ژن­های کنترل کننده تنش­های غیر­زنده………………………………………………………………………

 

 

 

24

 

 

1-4 ژن­های مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

24

 

 

1-4-1 پروتئین‌کینازها………………………………………………………………………………………………………………

 

 

 

26

 

 

1-4-2 خانواده ژنیMAPK  ……………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

28

 

 

1-4-3 ژن حساس به اکسین………………………………………………………………………………….

 

 

 

 

33

 

 

فصل دوم: مواد و روش­ها………………………………………………………………………

 

 

 

34

 

 

2-1 شرایط رشد………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

34

 

 

2-1-1 نحوه تیمار­دهی گیاهان…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

35

 

 

2-1-2  برداشت نمونه……………………………………………………………………………………………………………

 

 

 

35

 

 

2-1-2-1 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های مولکولی……………………………………………..

 

 

 

35

 

 

2-1-2-2 برداشت نمونه جهت انجام بررسی­های فیزیولوژیک………………………………………………………………

 

 

 

36

 

 

2-2 روش های بکار گرفته شده در آزمایشات مولکولی………………………………………………………………………..

 

 

 

36

 

 

2-2-1 پودر کردن و آماده سازی نمونه جهت استخراج RNA ………………………………………………………….

 

 

 

36

 

 

2-2-2 استخراج RNA از بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………………

 

 

 

36

 

 

2-2-3 اندازه­گیری میزان غلظت RNA و رقیق سازی نمونه­ها…………………………………………………………………..

 

 

 

37

 

 

2-2-4- روش تهیه cDNA………………………………………………………………………………………………

 

 

 

37

 

 

2-2-5- واکنش RT-PCR………………………………………………………………………………………………

 

 

 

38

 

 

2-2-6 تهیه ژل الکتروفورز……………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

38

 

 

2-2-6-1 تهیه TBE 5X…………………………………………………………………………………………………

 

 

 

38

 

 

2-2-7 پرایمر­های استفاده شده در این پژوهش………………………………………………………………………………………….

 

 

 

38

 

 

2-3 روش­های بکار گرفته شده در آزمایشات فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………

 

 

 

38

 

 

2-3-1  طرز تهیه عصاره گیاهی جهت تعیین میزان فعالیت آنزیم­های آسکوربات و گایاکول پراکسیداز…………………….

 

 

 

39

 

 

2-3-1-1 اندازه­گیری فعالیت آنزیم آسكوربات پراكسیداز(APX)………………………………………………………

 

 

 

39

 

 

2-3-1-2 اندازه­گیری فعالیت آنزیم گایاكول پراكسیداز(GPX)………………………………………………………..

 

 

 

39

 

 

2-3-2 سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

40

 

 

2-3-3 اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون چربی­ها (MDA)……………………………………………………………………………….

 

 

 

40

 

 

2-3-4 اندازه­گیری پروتئین کل…………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

41

 

 

2-3-5 اندازه­گیری قندهای محلول………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

41

 

 

2-4 آنالیزهای آماری…………………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

42

 

 

فصل سوم: نتایج………………………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

43

 

 

3-1 نتایج حاصل از بررسی­های انجام یافته در سطح مولکولی…………………………………………………………………………….

 

 

 

43

 

 

3-1-1 بررسی بیان ژن Protein Kinase تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)………………………….

 

 

 

45

 

 

3-1-2 بررسی بیان ژن MAPK4 تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)…………………………………….

 

 

 

46

 

 

3-1-3 بررسی بیان ژن MAPK3 تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)…………………………………….

 

 

 

48

 

 

3-1-4 بررسی بیان ژنAuxin responsive protein   تحت اثر تنش خشکی در گیاه کلزا (B.napus)……………

 

 

 

49

 

 

3-2 بررسی نتایج حاصل از آزمایشات فیزیولوژیکی…………………………………………………………………………………………….

 

 

 

49

 

 

3-2-1 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پر­اکسیداز (GPX) درگیاه کلزا………………………………

 

 

 

50

 

 

3-2-2 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) درگیاه کلزا……………………………..

 

 

 

52

 

 

3-2-3 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) درگیاه کلزا……………………………………………..

 

 

 

53

 

 

3-2-4 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان مالون­دی­آلدهید (MDA) درگیاه کلزا…………………………………………………

 

 

 

55

 

 

3-2-5  بررسی اثر تنش خشکی بر میزان پروتئین کل درگیاه کلزا…………………………………………………………………………..

 

 

 

55

 

 

3-2-6 بررسی اثر تنش خشکی بر میزان قندهای محلول درگیاه کلزا………………………………………………………………………

 

 

 

57

 

 

فصل چهارم: بحث و بررسی…………………………………………………………………………………………………………………………….

 

 

 

58

 

 

4-1- بررسی‌های انجام شده در سطح مولکولی……………………………………………………………………………………………………

 

 

 

61

 

 

4-2 بررسی­های انجام شده در سطح فیزیولوژیکی……………………………………………………………………………………………….

 

 

 

66

 

 

4-3 نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………………………………………………..

 

 

 

67

 

 

4-4 پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………….