۱-۱۵ ژل پلاکتی.. 13

 

۱-۱۶ عصاره پلاکتی.. 14

 

۱-۱۷ تأثیرات عصاره پلاکتی روی ترمیم زخم. 14

 

۱-۱۸ فاکتورهای رشد و مسیر سیگنالینگ اختصاصی‌شان. 19

 

۱-۱۹ فاکتور رشد رگ زایی.. 20

 

۱-۲۰ فاکتور رشد اپیدرمی.. 21

 

۱-۲۱ فاکتور رشد مشتق از پلاکت.. 22

 

۱-۲۲ فاکتور رشد تراریختی.. 24

 

۱-۲۳ اهداف طرح: 26

 

27

 

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است: 28

 

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی.. 30

 

۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه. 30

 

۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی.. 30

 

۲-۲-۳ پاساژ سلولی.. 31

 

۲-۲-۴ شمارش سلولی.. 32

 

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها 33

 

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده. 33

 

۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف.. 34

 

۲-۳ بررسی اثر عصاره پلاکتی بر تکثیر (فیبروبلاست) 35

 

۲-۴ بررسی اثر فرآورده عصاره پلاکتی بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 36

 

۲-۵ اندازه‌گیری میزان مهاجرت سلولی به روش  assay Scratch. 36

 

۲-۶ فرمول بکار رفته در تست خراشیدگی.. 37

 

۲-۷ بررسی بیان ژن. 37

 

۲-۷-۱ مراحل استخراج RNA.. 38

 

۲-۷-۲ تیمار RNA با DNAaseІ. 40

 

۲-۷-۳ تعیین جذب نوری و غلظت نمونه‌های RNA.. 40

 

۲-۷-۴ الکتروفورز، رنگ‌آمیزی و مشاهده RNA بر روی ژل آگارز. 40

 

۲-۷-۵ سنتز cDNA.. 42

 

۲-۷-۶ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز 43

 

۲-۷-7 پرایمر. 43

 

۲-۷-8 نحوه رقیق کردن پرایمر. 43

 

۲-۷-9 Real time PCR. 44

 

۲-۸ جمع‌آوری عصاره سلولی.. 46

 

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد. 46

 

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling  47

 

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز. 48

 

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ. 48

 

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها: 49

 

۲-۸-۶ مرحله Stripping. 50

 

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم. 51

 

۲-۹ آنالیزهای آماری.. 51

 

.. 53

 

۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست.. 54

 

۳-۲ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر درصد بقاء سلول‌های فیبروبلاست.. 56

 

۳-۳ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر مهاجرت سلول‌های فیبروبلاست    57

 

۳-۴ نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‌های مختلف لایزت پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر بیان ژن‌های Smad2 و Smad3 درسلول های فیبروبلاست تیمار شده. 62

 

۳-۴-۱ کیفیت RNA استخراج‌شده. 62

 

۳-۵ بررسی میزان بیان پروتئین‌های Smad2- P Smad3 Smad3 P Smad2 توسط وسترن بلات.. 68

 

.. 72

 

4-1 بحث.. 73

 

4-2 نتیجه گیری.. 79

 

۴-3 پیشنهاد‌ها 80

 

 

. 81

 

منابع انگلیسی.. 82

 

فهرست جداول

 

جدول 1- 1: لیست کامل از فاکتورهای رشد در پلاکت (22) 9

 

جدول 1- 2: لیستی از محتویات α گرانول‌های پلاکتی (۲۲) 11

 

جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده. 28

 

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی.. 29

 

جدول 2- 3: مواد و وسایل موردنیاز برای بررسی بیان ژن. 29

 

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات.. 30

 

جدول 2- 5: توالی پرایمر. 43

 

فهرست اشکال

 

شکل 1- 1: مرحله التهاب در فرایند ترمیم زخم (۱۴) 5

 

شکل1- 2: مرحله شکل گیری بافت در فرایند ترمیم زخم (14) 6

 

شکل 1- 3: اتصالات دو پلاکت در ایجاد لخته پلاکتی (22) 10

 

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم. 26

 

شکل 2- 1: کشت سلول در پلیت ۶ خانه. 36

 

شکل 2- 2: نحوه کشیدن خراش در تکنیک assay Scratch. 37

 

شکل 2- 3: ۳ فاز تشکیل‌شده در استخراج RNA.. 38

 

شکل 2- 4: نمای کلی از استخراج RNA.. 39

 

شکل 2- 5: RNA استخراج‌شده بر روی ژل اگاروز. 41

 

شکل 2- 6: ساختار شیمیایی سایبر گرین.. 44

 

شکل 2- 7: مکانیسم عمل سایبر گرین.. 45

 

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ. 49

 

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها 50

 

شکل 3- 1: بررسی افزایش تکثیر در غلظت‌های متفاوت عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف در مقایسه با گروه‌های کنترل در ۲۴ ساعت    55

 

. 55

 

شکل 3- 3: نمودار مربوط به تأثیر غلظت‌های متفاوت UCB-PL بر درصد بقا فیبروبلاست در این شکل علامت* به معنی تفاوت معنی‌دار گروه با غلظت ۱۰% در مقایسه با همه گروه‌های دیگر به‌جز گروه POS و ۱۵%-۸% است. 57

 

. 58

 

شکل 3- 5: سنجش اثر UCB-PL ۸% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 58

 

شکل 3- 6: سنجش اثر UCB-PL ۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 59

 

شکل 3- 7: سنجش اثر UCB-PL/FBS بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 60

 

شکل 3- 8: سنجش اثر FBS۱۰% بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 61

 

شکل 3- 9: سنجش اثر گروه کنترل منفی بر میزان مهاجرت سلولی در سلول‌های فیبروبلاست به روش scratching در ۴ زمان ۰-۶-۱۲-۲۴ ساعت بعد از خراش… 62

 

شکل 3- 10: کیفیت RNA استخراج‌شده در گروه‌های مختلف.. 63

 

شکل 3- 11: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

 

شکل 3- 12: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن GAPDH.. 64

 

شکل 3- 13: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad۲. 65

 

شکل 3- 14: نمودار Amplification Plot حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 65

 

شکل 3- 15: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با غلظت‌های مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad2. 66

 

شکل 3- 16: نمودار Melt Curve حاصل از Real-time PCR در فیبروبلاست های تیمار شده با دزهای مختلف از UCB-PL و بررسی بیان ژن smad3. 66

 

شکل 3- 17: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad2 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   67

 

شکل 3- 18: مطالعه اثر گروهای مختلف UCB-PL بر میزان بیان Smad3 در سلول‌های فیبروبلاست تیمار شده به روش Real time-PCR   68

 

شکل 3- 19: رنگ‌آمیزی ژل حاوی پروتئین‌ها 69

 

شکل 3- 20: وسترن بلات برای پروتئین Smad2. 70

 

شکل 3- 21: وسترن بلات برای پروتئین P Smad2. 70

 

شکل 3- 22: وسترن بلات برای پروتئین Smad3. 70

 

شکل 3- 23: وسترن بلات برای پروتئین p-Smad3. 71

 

چکیده

 

هدف: