1-6)نقش مهندسی متابولیک در توسعه سویه‌های صنعتی…………………………………………………………… 18

 

1-7) متابولیت‌های میکروبی …………………………………………………………………………………………………. 21

 

1-8)تعریف و تاریخچه آنتی بیوتیک ها………………………………………………………………………………….  24

 

1-9)گروه های میکروبی تولید آنتی بیوتیکها……………………………………………………………………………. 25

 

1-9-1)اکتینومایستها…………………………………………………………………………………………………………….. 26

 

1-9-1-1) باکتری Saccharopolyspora erythraea  ……………………………………………………………. 30

 

1-10)تقسیم‌بندی آنتی‌بیوتیک‌ها ……………………………………………………………………………………………. 31

 

1-10-1) طبقه‌بندی بر مبنای شباهت عمومی ساختار شیمیایی…………………………………………………… 31

 

1-10-1-1)ماکرولیدها ………………………………………………………………………………………………………… 33

 

1-10-2) طبقه‌بندی بر اساس مکانیسم عمل……………………………………………………………………………. 35

 

1-10-3)آنتی‌بیوتیک‌های بازدارنده سنتز پروتئین………………………………………………………………………..35

 

1-11)عوامل تعیین‌کننده حساسیت و مقاومت میکروارگانیسم ها به آنتی‌بیوتیک‌ها………………………… 36

 

1-12)انتخاب آنتی‌بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………………. 37

 

1-13)موارد کاربرد آنتی‌بیوتیک‌ها……………………………………………………………………………………………. 38

 

1-14)اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………. 38

 

1-14-1)تاریخچه و منبع………………………………………………………………………………………………………. 38

 

1-14-2)ساختمان و ویژگی‌های اریترومایسین…………………………………………………………………………. 40

 

1-14-3)آنتی‌بیوتیک‌های مشتق‌شده از اریترومایسین…………………………………………………………………. 42

 

1-14-4)فعالیت ضد‌باکتریایی اریترومایسین…………………………………………………………………………….. 43

 

1-14-5)مکانیسم عمل اریترومایسین……………………………………………………………………………………… 44

 

1-14-6)کاربردهای اریترومایسین و مشتقات آن………………………………………………………………………. 45

 

1-14-7)موارد منع مصرف اریترومایسین………………………………………………………………………………… 48

 

1-14-8)عوارض جانبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………. 48

 

1-14-9) انواع در دسترس……………………………………………………………………………………………………. 49

 

1-15)میکروارگانیسم های صنعتی………………………………………………………………………………………….. 49

 

1-16)جداسازی و نگهداری میکروارگانیسم‌ها…………………………………………………………………………. 50

 

1-17)جداسازی میکروارگانیسم‌های مناسب از محیط……………………………………………………………….. 51

 

1-18)کلکسیون‌های کشت…………………………………………………………………………………………………….. 52

 

1-19)نگهداری میکروارگانیسم‌ها…………………………………………………………………………………………… 53

 

1-19-1)نگهداری در دمای پایین…………………………………………………………………………………………… 53

 

1-19-1-1) نگهداری روی محیط‌کشت شیب‌دار حاوی آگار…………………………………………………….. 53

 

1-19-1-2)نگهداری با استفاده از روش ژرف انجمادی……………………………………………………………. 54

 

1-19-1-3)نگهداری در نیتروژن مایع…………………………………………………………………………………….. 55

 

1-19-2)نگهداری در حالت بدون آب……………………………………………………………………………………. 55

 

1-19-2-1)نگهداری در خاک……………………………………………………………………………………………….. 56

 

1-19-2-2)نگهداری در سیلیکاژل…………………………………………………………………………………………. 56

 

1-19-2-3)نگهداری در سلولز……………………………………………………………………………………………… 57

 

1-19-2-4)نگهداری در آب مقطر…………………………………………………………………………………………. 57

 

1-19-2-5)نگهداری در روغن……………………………………………………………………………………………… 57

 

1-19-2-6) لیوفیلیزه کردن…………………………………………………………………………………………………… 58

 

1-20) محیط کشت تخمیر صنعتی…………………………………………………………………………………………. 59

 

1-21) نیازهای غذایی میکروارگانیسم‌ها………………………………………………………………………………….. 61

 

1-21-1) کربن……………………………………………………………………………………………………………………. 62

 

1-21-1-1) عوامل موثر بر انتخاب منبع کربن…………………………………………………………………………. 62

 

1-21-2) نیتروژن   ……………………………………………………………………………………………………………. 63

 

1-21-3) هیدروژن و اکسیژن………………………………………………………………………………………………… 65

 

1-21-4) مواد معدنی…………………………………………………………………………………………………………… 65

 

1-22) تنظیم‌کننده‌های متابولیکی…………………………………………………………………………………………… .66

 

1-23) ضد کف‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 66

 

1-24) طراحی و فرمول‌بندی محیط کشت………………………………………………………………………………. 67

 

1-25) فرایند تخمیر تولید آنتی‌بیوتیک …………………………………………………………………………………….68

 

1-25-1) مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی‌بیوتیک …………………………………………………………68

 

1-25-2) بخش‌های اصلی فرآیند تخمیری……………………………………………………………………………… 68

 

 

1-25-3) تهیه مایع تلقیح و فرایند توسعه آن…………………………………………………………………………… 74

 

1-25-4) مرحله بذر (Seeding )………………………………………………………………………………………….. 77

 

1-25-5) مرحله نهایی (مرحله تولید)…………………………………………………………………………………….. 79

 

1-25-6) تکنولوژی تخمیر آنتی‌بیوتیک………………………………………………………………………………….. 82

 

1-25-6-1) تخمیر شیک فلاسک………………………………………………………………………………………….. 82

 

1-25-6-2) فرمانتورهای همزندار…………………………………………………………………………………………. 83

 

1-25-7) تاثیر دما بر فرایند تخمیر آنتی‌بیوتیک………………………………………………………………………… 84

 

1-25-7-1) انتقال حرارت و کنترل دما………………………………………………………………………………….. 86

 

1-25-8) تاثیر pH روی متابولیسم سلول………………………………………………………………………………….87

 

1-25-9) مرحله شناسایی و استخراج محصول………………………………………………………………………… 89

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………………………………… 91

 

فصل سوم: مواد و روش‌ها

 

3-1) میکروارگانیسم مورد استفاده………………………………………………………………………………………….. 97

 

3-2) معرف‌های رنگی مورد استفاده ……………………………………………………………………………………… 97

 

3-3) مواد لازم برای سنجش غلظت اریترومایسین……………………………………………………………………. 97

 

3-3-1) تهیه بافر pH 9.6…………………………………………………………………………………………………….. 97

 

3-3-2) تهیه بافر pH 4.2…………………………………………………………………………………………………….. 98

 

3-3-3) تهیه کلرفرم اشباع از بافر pH 9.6 و بافر  pH 9.6اشباع از کلرفرم…………………………………. 98

 

3-3-4) تهیه محلول برمو فنل بلو…………………………………………………………………………………………… 99

 

3-4) محیطهای کشت اسپوریزاسیون……………………………………………………………………………………… 100

 

3-4-1) محیط اسپورزایی…………………………………………………………………………………………………….. 100

 

3-4-1-1) باز کردن آمپول لیوفیلیزه………………………………………………………………………………………. 103

 

3-4-2) آزمایش ها با محیط‌کشت صنعتی برای تولید اریتروماسین……………………………………………..103

 

3-4-2-1) مرحله بذر‌دهی (Seeding)………………………………………………………………………………….. 103

 

3-4-2-1-1)تعیین pH هر کدام از ارلن‌ها…………………………………………………………………………….. 105

 

3-4-2-1-2) تعیین وزن تر بیومس (PMW )……………………………………………………………………….. 105

 

3-4-2-1-3)بررسی محیط‌های کشت از لحاظ آلودگی ( Contamination test )……………………… 106

 

3-4-2-2) مرحله تخمیر……………………………………………………………………………………………………….108

 

3-5) میزان اوره اضافه شده به محیط کشت تخمیر……………………………………………………………………109

 

3-5-1) اوره………………………………………………………………………………………………………………………..109

 

3-6) تجهیزات مورد استفاده در آزمایش ها …………………………………………………………………………….113

 

3-7) روش تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………………………………….113

 

3-8) روش سنجش غلظت اریترومایسین در نمونه های تخمیری………………………………………………..114

 

3-8-1) روش HPLC……………………………………………………………………………………………………………114

 

3-8-1-1) مقدمه ای بر کروماتوگرافی…………………………………………………………………………………….114

 

3-8-1-2) فاز ساکن و فاز متحرک…………………………………………………………………………………………118

 

3-8-1-3) اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام……………………………………………………………………….119

 

3-8-1-4) کاربردهای کیفی…………………………………………………………………………………………………..120

 

3-8-1-5) آنالیز کمی……………………………………………………………………………………………………………120

 

3-8-1-5-1) روش استاندارد خارجی(External Standard)……………………………………………………..120

 

3-8-1-5-2) روش افزایش استاندارد (Standard Addition)………………………………………………….. 121

 

3-8-1-5-3) استاندارد داخلی(Internal Standard)…………………………………………………………………121

 

3-8-1-6) نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………….122

 

3-8-2) روش TLC (Thin Layer Chromatography )…………………………………………………………..122

 

3-8-2-1) سیر تحولی و رشد……………………………………………………………………………………………….122

 

3-8-2-2) کوماتوگرافی لایه نازک (TLC )…………………………………………………………………………….123

 

3-8-2-3) کاربرد کروماتوگرافی لایه نازک……………………………………………………………………………..125

 

33-8-3) روش Spectrophotometric……………………………………………………………………………………126

 

3-8-3-1) با اسپکتروفوومتر آشنا شویم…………………………………………………………………………………..127

 

3-8-3-2) قانون بیر- لامبرت………………………………………………………………………………………………..128

 

3-8-3-3) استفاده از اسپکتروفوتومتر……………………………………………………………………………………..128

 

3-8-4) روش Bioassay………………………………………………………………………………………………………129

 

3-8-4-1) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین…………………………………………………………………….131

 

3-8-4-2) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین……………………………………………131

 

3-8-4-2-1) محیط کشت مولر هینتون آگار……………………………………………………………………………132

 

3-8-4-2-2) محیط کشت مولر هینتون براث………………………………………………………………………….132

 

3-8-4-3) تهیه مایه تلقیح…………………………………………………………………………………………………….133

 

3-8-4-4) ایجاد چاهک……………………………………………………………………………………………………….134

 

3-8-4-5) تهیه بافر فسفات با 8 = pH……………………………………………………………………………………134

 

3-8-4-6) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………….134

 

3-8-4-7) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها…………………………………………………………..135

 

3-8-4-8) اندازه گیری قطر هاله مهار شده……………………………………………………………………………..135

 

3-8-4-9) حذف و جایگزینی داده های گمراه کننده……………………………………………………………….136

 

3-8-4-10) رسم منحنی استاندارد…………………………………………………………………………………………136

 

3-8-5) استخراج اریترومایسین……………………………………………………………………………………………..137

 

3-8-5-1)تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………………………………….137

 

3-8-5-2) تهیه رقت های مایع تخمیر……………………………………………………………………………………139

 

3-8-5-3) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر……………………………………………………………………..139

 

3-8-5-4) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین با برموفنل‌بلو…………………………………………………..140

 

3-8-5-5) اندازه‌گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین- برموفنل‌بلو……………………………140

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1 ) بررسی اثر غلظت30 گرم‌درلیتر آرد‌سویا برروی پارامترهای مورد‌نظر در طی تخمیر……………..142

 

4-1-1 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا برروی pH محیط کشت تخمیر……………………….143

 

4-1-2 ) بررسی اثرغلظت30 گرم‌درلیترآردسویا برروی درصد وزن‌تر‌بیومس درمحیط تخمیر………….143

 

4-1-3 ) بررسی اثرغلظت30 گرم در لیترآرد سویا در میزان تولید اریترومایسین……………………………144

 

4-1-4)بررسی‌اثرغلظت30گرم‌درلیترآردسویابرروی‌مورفولوژی‌باکتری erythraea .S……………………..145

 

4-2)سنجش‌ومقایسه همزمان پارامترهای مورد بررسی درتمام غلظت‌ها درطی‌فرایند تخمیر……………148

 

4-2-1 ) سنجش و مقایسه pH در حالت‌های مختلف………………………………………………………………148

 

4-2-2 )سنجش و مقایسه درصد وزن تر بیومس تولید شده در حالت‌های مختلف……………………….149

 

4-2-3 )سنجش و مقایسه میزان اریترومایسین تولید شده در حالت‌های مختلف ………………………….150

 

4-2-4 ) تعیین غلظت بهینه اوره و سویا برای محیط کشت تولید اریترومایسین……………………………151

 

4-2-4-1)بررسی پارامترهای مختلف برای غلظت بهینه(40% اوره) در تولید اریترومایسین…………….151

 

4-2-4-1-1) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) در میزان تولید اریترومایسین………………………….. 151

 

4-2-4-1-2 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی pH محیط کشت ………………………………152

 

4-2-4-1-3 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی درصد وزن تر بیومس…………………………153

 

4-2-4-1-4 ) بررسی اثر غلظت بهینه (40% اوره) بر روی مورفولوژی باکتری…………………………….153

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادها

 

تاثیر ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک ها…………………………………….158

 

5-1) رابطه بین منابع نیتروژنی استفاده شده در محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین………………159

 

5-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف اوره و سویا به عنوان منبع نیتروژنی بر تولید اریترومایسین…160

 

5-2) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده و pH محیط کشت تخمیر…………………………………………162

 

5-3) رابطه بین رشد باکتری  Saccharopolyspora  erythraea و میزان تولید اریترومایسین………..163

 

5-4) رابطه بین میزان رشد باکتری  Saccharopolyspora  erythraea وتغییرات بیومس درطی فرایند تخمیر………………………………………………………………………………………………………………………………….165

 

5-4-1) سینتیک رشد میکروارگانیسم ها………………………………………………………………………………….165

 

5-5)رابطه بین مورفولوژی سویه Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین…………….169

 

5-6) برآورد هزینه‌ها…………………………………………………………………………………………………………….171

 

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی سویا دریک bach صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………………….172

 

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا در محیط تخمیر…………………………………………….172

 

5-6-1-2) استفاده از غلظت بهینه 40% اوره در محیط تخمیر…………………………………………………….173

 

5-7) پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………….175

 

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………………………………………..177

 

چکیده انگلیسی…………………………………………………………………………………………………………………. 184

 

ضمایم………………………………………………………………………………………………………………………………..185

 

عنوان                                           فهرست جداول                                             صفحه

 

جدول (1-1): راهنمای دوزاژ ماکرولیدهای خوراکی…………………………………………………………………..33

 

جدول (1-2): ویژگی های اریترومایسین…………………………………………………………………………………..40

 

جدول(1-3): نقش فیزیولوژیکی عناصر غذایی پرمقدار درون سلول و میزان متوسط مورد نیاز………….61

 

جدول(1-4 ): مهمترین منابع نیتروژن برای تولید تعدادی از متابولیت های ثانویه……………………………65

 

جدول(1-5): مراحل کلیدی فرایند تولید یک نوع آنتی بیوتیک…………………………………………………….72

 

جدول (1-6): محدوده بهینه دما برای گروه های باکتریایی………………………………………………………….85

 

جدول (3-1) : ترکیبات محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………….101

 

جدول(3 -2):  ترکیبات محلول میکروالمنت …………………………………………………………………………..101

 

جدول (3-3): ترکیبات محیط کشت بذردهی ………………………………………………………………………….104

 

جدول (3-4): محیط کشت مرحله تخمیر………………………………………………………………………………..108

 

جدول(3-5): خصوصیات اوره……………………………………………………………………………………………….111

 

جدول(3-6): آنالیز اوره…………………………………………………………………………………………………………112

 

جدول(3-7): غلظت‌های اریترومایسین در حجم‌های استاندارد اریترومایسین و حجم‌های مورد نیاز برای

 

تهیه آن‌ها……………………………………………………………………………………………………………………………..139

 

جدول ( 4-1 ) : غلظت‌های مختلف اوره و سویا استفاده شده در حالت‌های مختلف………………………148

 

عنوان                                            فهرست نمودارها                                         صفحه

 

نمودار ( 4-1): تغییرات pH در طی فرایندتولید اریترومایسین در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

 

نمودار(4-2): تغییرات درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در محیط حاوی 30گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….143

 

نمودار( 4-3) : میزان اریترومایسین تولید شده در روزهای مختلف تخمیر در غلظت 30 گرم در لیتر آرد سویا…………………………………………………………………………………………………………………………………….144

 

نمودار(4-4): تغییرات pH محیط کشت در طی فرایند تخمیر در غلظت‌های مختلف……………………..149

 

نمودار(4-5): درصد وزن تر بیومس تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر………………149

 

نمودار(4-6) : میزان اریترومایسین تولید شده در غلظت های مختلف طی فرایند تخمیر…………………150

 

نمودار(4-7): میزان اریترومایسین تولید شده را در حضور 40% درطی فرایند تخمیر………………………151

 

نمودار(4-8): تغییرات  pH در حضور 40% اوره درطی فرایند تخمیر…………………………………………..152

 

نمودار(4-9): درصد وزن تر بیومس در طی فرایند تخمیر در غلظت 40% اوره………………………………153

 

عنوان                                              فهرست اشکال                                       صفحه

 

شکل (3-1): روش تهیه کلروفرم اشباع از بافر و بافر اشباع از کلروفرم………………………………………….99

 

شکل (3-2): محیط اسپورزایی در روز چهارم انکوباسیون………………………………………………………….102

 

شکل (3-3): محیط اسپورزایی در روز چهاردهم انکوباسیون………………………………………………………102

 

شکل (3-4): فرمول شیمیایی و عکسی از اوره………………………………………………………………………….110

 

شکل (3-5): روش تهیه سوسپانسیون اسپوری………………………………………………………………………….113

 

شکل ( 3-6): نمونه ای از سرسمپلر فیلتردار…………………………………………………………………………….113

 

شکل (3-7): نمایی از دستگاه HPLC……………………………………………………………………………………..119

 

شکل (3-8): نمونه ای از یک کروماتوگرام………………………………………………………………………………119

 

شکل (3-9): نمایی از روش TLC………………………………………………………………………………………….125

 

شکل (4-1): مورفولوژی میسلیوم ها در روز چهارم تخمیر………………………………………………………..145

 

شکل (4-2): مورفولوژی میسلیوم ها در روز ششم تخمیر………………………………………………………….146

 

شکل (4-3): مورفولوژی میسلیوم ها در روز هشتم تخمیر…………………………………………………………146

 

شکل (4-4): مورفولوژی میسلیوم ها در روز دهم تخمیر……………………………………………………………147

 

شکل (4-5): مورفولوژی میسلیوم ها در روز یازدهم تخمیر……………………………………………………….147

 

شکل(4-6): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز چهارم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره……………………………………………………………………………………………………………………154

 

شکل(4-7): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز ششم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………..154

 

شکل(4-8): مورفولوژی میسلیوم های Saccharopolyspora erythraea در روز هشتم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره………………………………………………………………………………………………………………..155

 

شکل(4-9): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز دهم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………155

 

شکل(4-10): مورفولوژی میسلوم های Saccharopolyspora erythraea در روز یازدهم تخمیر در

 

غلظت 40% اوره…………………………………………………………………………………………………………………156

 

 

 

چکیده فارسی

 

صنعت بیوتکنولوژی دارویی یعنی بکارگیری میکروارگانیسم‌های مولد با هدف تولید یک محصول بیوسنتزیک مورد مصرف در درمان و دارو. میکروارگانیسم‌ها قادرند بسیاری از مواد و ترکیبات مهم صنعتی را که بسادگی از منابع دیگر قابل تهیه نیستند تولید کنند. از جمله ترکیبات تولید شده توسط میکروارگانیسم ها، متابولیت‌های ثانویه نظیر آنتی بیوتیک ها هستند. اریترومایسین یک آنتی‌بیوتیک ماکرولیدی است و اهمیت آن در این است که می‌تواند جایگزین پنی‌سیلین ها و تتراساکلین ها در بیمارانی باشد که به این داروها حساسیت مفرط دارند. بدست آوردن حداکثر میزان تولید اریترومایسین مستلزم وجود یک محیط کشت کاملاً متوازن است. تاکنون فنون زیادی برای افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه بکار رفته است، از جمله تغییر ترکیبات موجود در محیط کشت با منابع ارزانتر.تاکنون در مورداثر استفاده از منبع اوره بر روی رشد  erythraea   Saccharopolysporaو تولید اریترومایسین گزارشی نشده است.