2-1-3. کاربرد لیپو پلی ساکارید در مطالعات ایمونولوژیکی………………………………………………………………. 19

 

2-1-3-1. نقش لیپو پلی ساکارید باکتریایی در افزایش پاسخ ایمنی به کاندیدا آلبیکنز……………….. 19

 

2-1-3-2. نقش لیپو پلی ساکارید در تسریع ترمیم زخم اپیتلیوم مجاری تنفسی…………………………. 21

 

2-1-3-3. قابلیت میتوژنی لیپو پلی ساکارید در تکثیر لنفوسیت‌های B…………………………………………. 21

 

2-1-3-4. اثر لیپو پلی ساکارید بر پرولیفراسیون فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 22

 

2-1-3-5. اثر سینرژیسمی‌پروتئین نوترکیب CagA و لیپو پلی ساکارید در بروز پاسخ ایمنی مناسب علیه هلیکوباکتر پیلوری…………………… 23

 

2-1-3-6. نقش حفاظتی لیپو پلی ساکارید در بقای پیوند سلول‌های بنیادی…………………………………. 24

 

2-1-3-7. فعالیت ضد سرطانی لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………… 25

 

2-2. سالمونلا………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 28

 

2-2-1. پاسخ ایمنی میزبان به عفونت سالمونلایی……………………………………………………………………………… 29

 

2-2-1-1. پاسخ ایمنی ذاتی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………………… 29

 

2-2-1-2. پاسخ ایمنی اکتسابی علیه سالمونلا………………………………………………………………………………….. 30

 

2-2-1-3. سایتوکاین‌ها و کموکاین‌های دخیل در عفونت سالمونلایی……………………………………………… 30

 

2-3. التهاب…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 31

 

2-3-1. ویژگی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………….. 31

 

2-3-2. میانجی‌های التهاب…………………………………………………………………………………………………………………… 32

 

2-4. لیپو پلی ساکارید و التهاب……………………………………………………………………………………………………………. 33

 

2-5. سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………………………………………… 34

 

2-5-1. تاریخچه ی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………………….. 35

 

2-5-2. ساختار پروتئینی سیکلو اکسیژناز…………………………………………………………………………………………… 35

 

2-5-3. سیکلو اکسیژناز‌ها و سنتز پروستانوئید‌ها………………………………………………………………………………… 36

 

2-5-4. اعمال پروستاگلاندین‌ها……………………………………………………………………………………………………………. 37

 

2-5-5. بیولوژی سیکلو اکسیژناز………………………………………………………………………………………………………….. 37

 

2-5-6. فیبروبلاست و سیکلو اکسیژناز……………………………………………………………………………………………….. 38

 

2-5-7. نقش سیکلو اکسیژناز-2 در آنژیوژنز………………………………………………………………………………………. 39

 

2-5-8. سیکلو اکسیژناز و لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………………………….. 40

 

2-6. هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………………………….. 43

 

2-6-1. تاریخچه‌ی هیدروژن پر اکسید………………………………………………………………………………………………… 43

 

2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید……………………………………………………………………………………………………. 44

 

2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن……………………………………………………………………………………………………… 45

 

2-6-4. ROS و منابع تولید آن……………………………………………………………………………………………………………. 46

 

2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………………….. 47

 

2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی………………………………………………………………………………………….. 49

 

2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC)………………………. 50

 

2-7. نیتریک اکسید………………………………………………………………………………………………………………………………. 51

 

2-7-1. سنتز نیتریک اکسید……………………………………………………………………………………………………………….. 52

 

2-7-2. عملکرد NOS…………………………………………………………………………………………………………………………… 53

 

2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO…………………………………………………………………………………………………….. 53

 

2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی……………………………………………………………………………………………………….. 53

 

2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی…………………………………………………………………………………………………… 54

 

2-7-6. نقش NO در التهاب………………………………………………………………………………………………………………… 54

 

2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی………………………………………………………………………………………………….. 55

 

2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول…………………………………………………………………………………………………….. 55

 

2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2……………………………………………………………………………………………….. 55

 

2-7-10. نقش iNOS در تکثیر…………………………………………………………………………………………………………… 56

 

2-8. پوست…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

 

2-8-1. فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………………………………. 58

 

2-9. زخم……………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61

 

2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روز‌های مختلف…………………………………………………………………………….. 61

 

2-9-1-1. 24 ساعت اول…………………………………………………………………………………………………………………….. 61

 

2-9-1-2. روز سوم……………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

 

2-9-1-3. روز پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………… 62

 

2-9-1-4. هفته‌ی دوم………………………………………………………………………………………………………………………….. 62

 

 

2-9-1-5. اواخر ماه اول……………………………………………………………………………………………………………………….. 62

 

2-9-2. مراحل ترمیم زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 63

 

2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی…………………………………………………………………………………………………………………… 63

 

2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب…………………………………………………………………………………………. 67

 

2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها……………………………………………………………………………………… 67

 

2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر…………………………………………………………………………………………………………………….. 67

 

2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 68

 

2-9-2-2-2. فیبروپلازیا………………………………………………………………………………………………………………………. 68

 

2-9-2-2-3. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 69

 

2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی………………………………………………………………………………………………………………… 69

 

2-9-3. اهمیت ماکروفاژ‌ها در التیام زخم……………………………………………………………………………………………. 69

 

2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم………………………………………………………………………………………………….. 70

 

2-9-3-2. اثر ماکروفاژ‌ها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها………………………………………………………. 71

 

2-9-3-3. ماکروفاژ‌ها در مرحله‌ی التهاب……………………………………………………………………………………………. 72

 

2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید……………………………………………………………………………………………………….. 73

 

2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم………………………………………………………………… 77

 

2-9-4-1-1. انعقاد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 77

 

2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی…………………………………………………………………………………………………… 78

 

2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 78

 

2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس……………………………………………………………………………………………. 79

 

2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم………………………… 80

 

2-9-5. نیتریک اکسید و زخم……………………………………………………………………………………………………………… 82

 

2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم………………………………………………………………………….. 82

 

2-9-5-1-1. التهاب……………………………………………………………………………………………………………………………… 83

 

2-9-5-1-2. آنژیوژنز……………………………………………………………………………………………………………………………. 83

 

2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون………………………………………………………………………………………………………… 83

 

2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی…………………………………………………………………………………………… 84

 

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم……………………………………………………………………………….. 85

 

فصل سوم: مواد و روش‌ها

 

3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش………………………………………………………………………. 89

 

3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته………………………………………………………………………………. 91

 

3-2-1. محیط کشت DMEM…………………………………………………………………………………………………………….. 91

 

3-2-2. FBS………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 91

 

3-2-3. بافر PBS…………………………………………………………………………………………………………………………………… 91

 

3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست………………………………………………………………………………………………………. 91

 

3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید……………………………………………………………………….. 92

 

3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها…………………………………………………………………………………….. 93

 

3-6. رنگ‌آمیزی XTT…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

 

3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………. 95

 

3-8. شمارش سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………. 95

 

3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها………………………………………………………………………………………………… 95

 

3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی………………………………………………………. 96

 

3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………. 96

 

3-10-2. روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………… 96

 

3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی……………………………………………….. 97

 

3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 97

 

3-11-2. منحنی استاندارد H₂O₂……………………………………………………………………………………………………….. 98

 

3-11-3. مخلوط واکنش………………………………………………………………………………………………………………………. 98

 

3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی…………………………………………………… 98

 

3-12-1. مواد………………………………………………………………………………………………………………………………………… 99

 

3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 99

 

3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها………………………………………………………………………………………………………………… 99

 

3-12-4. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 100

 

3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق…………………………………………………………………… 101

 

3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………………………………………… 101

 

3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی……………………………………………………………….. 101

 

3-13-1-2. بستر مناسب………………………………………………………………………………………………………………….. 103

 

3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی………………… 103

 

3-13-1-4. تغذیه……………………………………………………………………………………………………………………………… 104

 

3-14. اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………………………………………………………… 105

 

3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید…………………………………………………………………………………………….. 107

 

3-16. آماده‌سازی لیزات بافت……………………………………………………………………………………………………………. 109

 

3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده………………………………………………………. 110

 

3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 110

 

3-17-2. روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………… 110

 

3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده…………………………………………. 111

 

3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها……………………………………………………………………………………………………………… 111

 

3-18-2. منحنی استاندارد H₂O₂…………………………………………………………………………………………………….. 111

 

3-18-3. مخلوط واکنش……………………………………………………………………………………………………………………. 112

 

3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده……………………………………….. 112

 

3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده………………………………………………………………………. 113

 

3-21. آنالیز آماری……………………………………………………………………………………………………………………………… 113

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)……………………………. 116

 

4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با استفاده از روش XTT….. 117

 

4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)      118

 

4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   119

 

4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)       121

 

4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)     122

 

4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H₂O₂ در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)     123

 

4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H₂O₂ در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز)   124

 

4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)  125

 

4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز)………….. 126

 

4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف……………………………………………….. 127

 

4-12. اثر LPS بر میزان H₂O₂ در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف…………………………………………….. 128

 

4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روز‌های مختلف………………………………………… 129

 

4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………. 132

 

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

 

5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست……………………………………………………… 138

 

5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo…………………………………………………………… 142

 

5-3. اثر LPS بر میزان NO، H₂O₂ و COX-2 در شرایط invitro………………………………………………… 144

 

منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 149

 

خلاصه انگلیسی……………………………………………………………………………………………….. 162

 

فهرست جداول

 

جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم………………….. 135

 

فهرست نمودارها

 

نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)…………………………… 116

 

نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت)…………………………… 117

 

نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)……………….. 118

 

نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 119

 

نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)………. 120

 

نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار)…….. 120

 

نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)       121

 

نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) … 122

 

نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H₂O₂ بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار)     123

 

نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H₂O₂ با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) . 124

 

نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) .. 125

 

نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) ……. 126

 

نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم       127

 

نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H₂O₂ پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم     128

 

نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم  129

 

فهرست اشكال

 

شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. 14

 

شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد 15

 

شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر………………………………………………………………………………………………………. 16

 

شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی…………………………………………….. 19

 

شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس…………………………………………………………………………………………………………… 28

 

شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب…………………………………………………………………………………………………………. 31

 

شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک…………………………………………………………………………………………….. 33

 

شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول…………………………………………………………… 34

 

شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها……………………………………………………………………………………………… 36

 

شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز………………………………………………………………………………………………… 40

 

شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE₂………………………………………………………………………………………………….. 41

 

شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2………………………………………………….. 42

 

شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS…………………………………………………………………………………………………. 47

 

شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی………………………………………………………………….. 48

 

شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی………………………………………………………………………………………. 50

 

شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید…………………………………………………………………………………………… 52

 

شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS…………………………………………………………………. 57

 

شکل  2-18. فیبروبلاست…………………………………………………………………………………………………………………….. 58

 

شكل 2-19. نمایی شماتیک از اندامک‌های داخلی فیبروبلاست……………………………………………………….. 60

 

شکل 2-20. مراحل ترمیم زخم پوستی……………………………………………………………………………………………… 63

 

شکل 2-21. نگاهی کلی به فاز التهابی ترمیم زخم……………………………………………………………………………. 65

 

شکل 2-22. روز سوم زخم (فاز التهابی)……………………………………………………………………………………………… 66

 

شکل 2-23. روز پنجم زخم (مرحله‌ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ‌سازی)…………………………………………. 66

 

شکل 2-24. کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها      72

 

شکل 2-25. اثر سلول‌های مختلف در ترمیم زخم……………………………………………………………………………… 73

 

شکل 2-26. مدل فرضی از نقش گونه‌های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال‌دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول‌های اپیتلیال…………………. 80

 

شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن………………………………………………………………………… 84

 

شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی……………………………………………………………………. 94

 

شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی……………………………………………………………………………………. 101

 

شکل 3-3. نحوه قرارگیری موش‌های آزمایشگاهی در قفس‌های مخصوص…………………………………….. 105

 

شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم………………………………………………………………………………… 107

 

شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم…………………………………………………………………….. 108

 

شکل 3-6. نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی…………….. 109