3-1 مواد مورد استفاده…………………………………………………………………………………. 27

 

3-1-1 باکتری مورد استفاده…………………………………………………………………………………………… 27

 

3-1-2 پلاسمید………………………………………………………………………………………………………………………. 27

 

3-1-3 انزیم ها……………………………………………………………………………………………………………….. 28

 

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………………….. 28

 

3-1-5 انتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………………………. 28

 

3-1-6 محیط کشت ………………………………………………. 28

 

3-1-7 ژل ………………………………………………………………………. 28

 

3-1-8 مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………………. 28

 

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………………. 28

 

3-2  انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه V پروتئینALCAM.. …………………………………………………………………… 34

 

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر………………………………………………………………………………………………….. 34

 

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………….. 35

 

3-3 سنتز شیمیایی DNA ناحیه V پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………… 35

 

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب……………………………………………………………………………………………….. 35

 

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده………………………………….. 35

 

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه……………………………………………………………………………………. 36

 

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK  حاوی DNA ناحیهV پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 36

 

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته………………………………………………………………………………………………. 36

 

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………. 36

 

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………………………………….. 37

 

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli…………………………………………………………… 38

 

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 38

 

3-4-3 ارزیابی کلونی ها………………………………………………………………………………………………………. 39

 

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺ pBSK  حاوی DNA ناحیه Vپروتئین ALCAM………………………………………………… 39

 

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده……………………………………………………………. 41

 

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion………………………………………………………………………………… 42

 

3-4-5-2 الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………….. 42

 

3-5 ساب کلونینگ ژن ناحیهV  پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………….. 44

 

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه Vاز ژل……………………………………………………………….. 44

 

3-5-2 ………………………………………………………………………….. 46

 

3-5-3 ترانسفورماسیون…………………………………………………………………………………………………… 46

 

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 47

 

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………… 48

 

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………. 48

 

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژن ناحیه VپروتئیALCAM……………………………………………………. 49

 

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج ……….. 51

 

3-6  بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………….. 52

 

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک IPTG…………………………………………………………………………. 52

 

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page………………………………………………………………. 52

 

3-6-2-1 محتویات كیت.    SDS-page     ……………………………………………………………………..53

 

3-6-2-2روش انجام  SDS_page………………………………………………………………… 54

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1نتایج حاصل از  انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAM…………………………………… 58

 

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization…………………………………… 58

 

4-2 سنتز شیمیایی DNA ناحیه …………………………………………… 63

 

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSKحاوی DNA ناحیه VپروتئینALCAM……………………………………………………….. 65

 

4-4 ساب کلونینگ ژن ناحیه V پروتئین ALCAM………………………………………………………………………………. 66

 

4-5 بیان پروتئین ناحیه V پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page………………………….. 69

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

بحث……………………………… 71

 

نتیجه گیری……………… 83

 

 

منابع……………………………………… 84

 

چکیده انگلیسی………………………………..91

 

فهرست شکل ها

 

عنوان                                                                                                                          صفحه

 

شکل1-1. نمای شماتیک از ساختار پروتئینALCAM…………………………………………………………………….. 4

 

2-1 رنگ امیزی ایمنوهیستوشیمیاییALCAM در بافت توموری………………………………………………….. 5

 

شکل 1-3. اناتومی کولون و رکتوم…………………………………………………………………………………….. 7

 

شکل1-4 مرحله صفر سرطان کولورکتال……………………………………………………………. 10

 

شکل1-5 مرحلهƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال…………………………………… 11

 

شکل1-6 مرحلهƖƖ از پیشرفت سرطان کولورکتال……………………………………. 11

 

شکل 1-7 مرحلهA]]] از پیشرفت سرطان کولورکتال………………………… 12

 

شکل1-8. مرحله. B. ƖƖƖاز گسترش سرطان کولورکتال…………………………………….. 12

 

شکل 1-9 مکانسیم ناپایداری میکروستلایت………………………………………………………… 18

 

شکل 1-10 تفاوت های پاتولوژی بین تومورهایی که ناپایداری کروموزومی و میکروستلایت…………………………………………………. 19

 

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ……………………………………………………………………………….. 29

 

شکل 3-2.شیکر انکوباتور…………………………………………………………………………………….. 30

 

شکل  3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 30

 

شکل 3-4. تانک الکتروفورز (SDS-Page)…………………………………………………………………. 31

 

شکل 3-5…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ…………………………………………. 31

 

شکل3-6. سانتریفیوژ اپندورف المان……………………………………………………………………….. 32

 

شکل 3-7… بن ماری………………………………………………………………………………………………….. 32

 

شکل 3-8… انکوباتور………………………………………………………………………………………. 33

 

شکل 3-9 دستگاه تصویرساز ژل………………………………………………………………………….. 33

 

شکل 3-10 سانتریفوژ یخچال دار. ……………………………………………………………………… 34

 

شکل 3-11 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز………………………………………………… 39

 

شکل3-12 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز…………………………………………… 44

 

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………. 60

 

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد از بهینه سازی …………………………….. 60

 

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…………………………….. 60

 

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli………………………… 61

 

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………… 63

 

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم  انزیمی   ………………………………………………………….65

 

  شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNAناحیهV………………………………………………………………………………. 66

 

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی ناحیهVپروتئینALCAM.             …………………………………………………………….. 67

 

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK………………………………………………. 67

 

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید  pet-28a………………………………………………………….. 68

 

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن ناحیه …………………………………….. 69

 

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه Vدر باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………. 69

 

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………. 70

 

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ………………………………………………………………. 71

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1 میزان بروز و مرگ ومیر سرطان کولورکتال در ایران و کشور های همسایه ایران در هر صد هزارنفر…………………….. 8

 

 

 

چکیده

 

مقدمه :

 

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده ایمنوگلوبولین ها ALCAM مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده می باشد.این پروتئین در گسترش تومورزایی سرطان کولورکتال نقش داشته و به عنوان مارکر سلول های بنیادی سرطان عمل می کند.بیان این پروتئین به طور قابل توجهی در سرطان کولورکتال نسبت به بافت نرمال افزایش پیدا می کند

 

سرطان کولورکتال با 2/1 مورد جدید در سال که منجر به مرگ 600 هزار نفر در سال می شود  نزدیک به ⅓ از رایج ترین نوع تومورها را تشکیل می دهند. که از این نظر  دومین نوع شایع از سرطان های بدخیم در سرتاسر جهان می باشد.از طرفی با توجه به متاستاز ان به نواحی مختلف بدن همچون کبد و ریه در مراحل پیشرفته بیماری ،تنها در صورتی که در مراحل اولیه تشخیص داده شود قابل درمان می باشد. در این تحقیق ما ناحیه Vپروتئین ALCAM را که به عنوان مهمترین بخش در تعاملات پروتئین نقش دارد جهت سنتز انتخاب نمودیم. پروتئین ALCAM نیز به عنوان مارکر سلول های سرطان کولورکتال ، با توجه به بیان ان در مراحل مختلف از پیشرفت بیماری در سطح سلول های سرطان کولورکتال می تواند به عنوان یک هدف مناسب جهت استفاده از ان در کارهای درمانی مثل ساخت واکسن و یا تهیه کیت تشخیصی برای سرطان کولورکتال مورد استفاده قرار گیرد.

 

روش کار :

 

در این تحقیق ابتدا توالی مورد نظر را با استفاده از بانک های اطلاعات ژنی استخراج  و سپس به وسیله انالیز

 

بیو انفورماتیکی توالی مورد نظر  جهت بهترین بیان در میزبان مناسب بهینه سازی شد. توالی مورد نظر به روش شیمیایی سنتز و سپس قطعه سنتز شده را در میزبان مناسب با استفاده از فرایند کلونینگ و از طریق وکتور بیانی مناسب انتقال داده  شده و تکثیر پیدا کرد.در برسی استفاده از القاگر مناسب بیان ژن ناحیه سنتز شده  در میزبان      بررسی شد.  SDS-pageاستفاده از تکنیک    نوترکیب القا و پروتئین مورد نظر با

 

بحث و نتیجه گیری :

 

این قطعه ژنی توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین ناحیه V را تولید کند. از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیصی سرطان کولورکتال به واسطه تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن، سیستم ایمنی فرد را جهت پیش گیری از ابتلا به سرطان تقویت کرد.

 

واژه های کلیدی: سرطان کولورکتال، ژن ناحیهV، انالیز بیوانفورماتیکی ،کلونینگ

 

فصل اول  :   مقدمه

 

1-1 پروتئین ALCAM(CD166)

 

یک گلیکوپروتئین  گذرنده از غشا از  خانواده(ALCAM )مولکول چسبنده لکوسیت فعال شده

 

ایمنوگلوبولین[1] هاست که دارای یک دومین خارج سلولی با 500 امینو اسید ، یک دومین گذرنده از غشا به طول 22 امینو اسید و هم چنین یک دومین کوتاه سیتوپلاسمی به طول 34 امینو اسید می باشد.(اولریچ وایدله و همکاران[2]،2010؛  مایکل بوون و همکاران[3] ،2010 ؛توماس برورنر و         )و از 163q13.1q13.2همکاران[4]،2012) ژن انسانی این پروتئین بروی کروزوم 3 قرار دارد(

 

1-4-6-2- پرتو درمانی (درمان با اشعه) ……………………………………………………………………….. 14

 

1-2 پروتئین CD166 …………………………………………………………………………………………………… 15

 

1-4 مساله تحقیق ………………………………………………………………………………… 17

 

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

 

2-1 ALCAM در درمان سرطان………………………………………………………………………………………… 19

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1 مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………… 24

 

3-1-1 باکتری مورد استفاده……………………………………………………………………………………. 24

 

3-1-2 پلاسمید…………………………………………………………………………………………………………………….. 24

 

3-1-3 انزیم ………………………………………………………………………………………. 25

 

3-1-4 کیت های ازمایشگاهی……………………………………………………………………………………… 25

 

3-1-5 انتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………………….. 25

 

3-1-6 محیط کشت باکتری………………………………………………………………….. 25

 

3-1-7 ژل الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 25

 

3-1-8 مواد شیمیایی…………………………………………………………………………. 25

 

3-1-9 وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی……………………………………………………………………… 25

 

3-2  انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه ALCAM.. ………………………………………………………………………………………………… 31

 

3-2-1 استخراج توالی مورد نظر…………………………………………………………………………….. 31

 

3-2-2 بهینه سازی توالی یا Optimization………………………………………………………………………………………………………. 32

 

3-3 سنتز شیمیایی DNA  ALCAM………………………………………………………………………………….. 32

 

3-3-1 سنتز شیمیایی ژن نوترکیب………………………………………………………………………………………….. 32

 

3-3-2 پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده…………………………………………………………………….. 32

 

3-3-3 محلول سازی DNA لیوفیلیزه………………………………………………………………………….. 33

 

3-4 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK  حاوی DNA پروتئین ALCAM ………………………………………………………………………. 33

 

3-4-1 اماده سازی باکتری شایسته…………………………………………………………………………………….. 33

 

3-4-1-1 مواد و محلول ها…………………………………………………………………………………….. 33

 

3-4-1-2 روش کار…………………………………………………………………………………………….. 34

 

3-4-2 ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli………………………………………………………….. 35

 

3-4-2-1 روش کار……………………………………………………………………………………………….. 35

 

3-4-3 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………………….. 36

 

3-4-4 استخراج پلاسمید – AMP⁺ pBSK  حاوی DNAپروتئین ALCAM…………………………………………………………… 36

 

3-4-5 تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 38

 

3-4-5-1 هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion…………………………………………………………………………………… 39

 

3-4-5-2 الکتروفورز…………………………………………………………………………………………….. 39

 

3-5 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………. 39

 

3-5-1 تخلیص DNA ناحیه CD166از ژل…………………………………………. 39

 

3-5-2 لایگیشن……………………………………………………………………………………………………………… 43

 

3-5-3 ترانسفورماسیون……………………………………………………………………………………………………….. 43

 

3-5-3-1 اماده سازی سلول های شایسته……………………………………………………………………. 44

 

3-5-3-2 ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن…………………………………………. 45

 

3-5-4 ارزیابی کلونی ها…………………………………………………………………………………………………….. 45

 

3-5-5 استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژنپروتئین ALCAM……………………………………………………………. 46

 

3-5-6 تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده…………………………………………………………. 48

 

3-6  بیان پروتئین پروتئین ……………………………………….. 48

 

3-6-1 القاء بیان پروتئین به کمک …………………………………………… 49

 

3-6-2 بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page……………………………………………………………………………………………………………. 49

 

3-6-2-1 محتویات كیت.    SDS-page     ………………………………………………………………………………………………………………… 50

 

3-6-2-2روش انجام  SDS_page………………………………………………………………………………………………………………. 51

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1نتایج حاصل از  انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین پروتئین ALCAM…………………………………………………………. 55

 

4-1-1 نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization……………………………………………………………………………….. 55

 

4-2 سنتز شیمیایی DNA پروتئین ALCAM……………………………………………………………………………………………………………….. 60

 

 

4-3 کلونینگ پلاسمید- AMP⁺pBSKحاوی DNA پروتئینALCAM…………………………………………………………………………… 62

 

4-4 ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM…………………………………………………………………………………………. 63

 

4-5 بیان پروتئین پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page…………………………………………….. 66

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

بحث…………………………….. 68

 

نتیجه گیری…………………………………………. 80

 

منابع…………………………………. 81

 

فهرست شکل ها

 

شکل1-1.  ساختار پروتئینALCAM………………………………………………………………………………………………………. 4

 

شکل3- 1انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین ………………………………………………………………. 26

 

شکل 3-2.شیکر انکوباتور……………………………………………………………………………………… 27

 

شکل  3-3. تانک الکتروفوز افقی………………………………………………………………………………………….. 27

 

شکل 3-4…. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ………………………………….. 28

 

شکل3-5. سانتریفیوژ اپندورف المان………………………………………………………………………………………… 29

 

شکل 3-6… بن ماری…………………………………………………………………………………………………………………………………. 29

 

شکل 3-7… انکوباتور………………………………………………………………………………………………………………… 30

 

شکل 3-8 دستگاه تصویرساز ژل……………………………………………………………………………………………………. 30

 

شکل 3-9 کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز……………………………………………………… 36

 

شکل3-10 کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز………………………………………… 41

 

شکل 4-1 شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی…….. 57

 

شکل4-2 … میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد ازبهینه سازی…………………………………………. 57

 

شکل 4-3 . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی………………………………………………….. 57

 

شکل 4-4. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli…………………………………………58

 

شکل 4-5. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی……………………………………………………………………. 60

 

شکل 4-6. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم  انزیمی   ……………………………………………………………………………………………….62

 

شکل 4-7. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA…………………………………………………………………………………………. 63

 

شکل4-8تایید حضور پلاسمید حاوی پروتئینALCAM.             ……………………………………………………………………………………… 64

 

شکل 4-9. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK…………………………………………………………………………………………. 64

 

شکل 4-10. نقشه ژنی پلاسمید  pet-28a……………………………………………………………………………………………. 63

 

شکل 4-11باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن………………………………………………………………….. 66

 

شکل 4-12. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3)………………………………… 66

 

شکل 4-13نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه………………………………………………………………………… 67

 

شکل4-14 بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ……………………………………………………………………….. 68

 

چکیده

 

مقدمه :

 

سرطان کولورکتال به عنوان چهارمین سرطان شایع در دنیا با برآورد 2/1میلیون مورد جدید در سال می باشد. این سرطان با توجه به متاستاز به نواحی مختلف بدن به خصوص کبد و ریه در مراحل پیشرفت بیماری یکی از کشنده ترین نوع از سرطان های بدخیم می باشد.هم چنین این سرطان رتبه سومین نوع از سرطان های شایع در زنان و پنجمین نوع در میان مردان در ایران درارا می باشد.

 

CD166 یکی از پروتئین های سطحی سلولهای سرطانی در سرطان کولورکتال است که با سرطانی شدن سلول ها میزان بیان سطحی آن بیشتر می شود. از این جهت می توان از آن به عنوان مارکر مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در این مطالعه ما برآن شدیم که  تا با استفاده از کلون کردن و بیان پروتئین سطحی CD166 زمینه برای استفاده از آن جهت تولید واکسن و یا کیت تشخیص سرطان کولورکتال فراهم شود.

 

روش کار :

 

در این مطالعه ابتدا توالی ژن موردنظر به کمک بانک های اطلاعات ژنی انتخاب شد. سپس توالی موردنظر را آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفت. ژن آنالیز شدن به روش شیمیایی سنتز شد و سپس با استفاده از فرآیند کلوینگ ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال و تکثیریافت.

 

در انتها نیز بیان ژن موردنظر را در باکتریهای نوترکیب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئین موردنظر به کمک تکنیک sDs-page مورد بررسی قرار گرفت.

 

بحث و نتیجه گیری :

 

ژن موردنظر توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین موردنظر را تولید کند.

 

از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیص سرطان کولورکتال به واسطه ی تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن ، سیستم ایمنی فرد را جهت پیشگیری از ابتلا به سرطان کولورکتال تقویت نمود.

 

1-6-1: مننژیت… 15

 

1-7:درمان: 15

 

1-7-1: واکسن های موثر و مقایسه آنها 15

 

1-8: تشخیص: 18

 

1-8-1: روش کشت… 18

 

1-8-2: روش آگلوتیناسیون لاتکس (LAT). 19

 

1-8-3: روش مولکولی.. 19

 

1-9: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 19

 

1-9-1: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی.. 21

 

1-9-1-1: منطقه I. 22

 

1-9-1-3: منطقه II. 22

 

1-9-1-2: منطقه III. 22

 

1-9-1-4: قطعه IS1016 23

 

1-9-1-5: تعداد کپی جایگاه cap. 24

 

1-9-1-6: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 25

 

1-9-1-7: ژنوتیپ های Hib.. 27

 

1-10: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا: 28

 

1-11: Real-time PCR.. 28

 

1-11-1: تعریف و مفهوم : 28

 

1-11-2: مزایای روش Real-time PCR: 29

 

1-11-3: انواع روش های Real-time PCR: 29

 

1-11-4: روش های تعیین کمیت با Real-time PCR: 32

 

1-11-4-1: Absolute Quantification : 32

 

1-11-4-2: چگونگی رسم یک منحنی استاندارد: 32

 

1-11-4-3: Relative Quantification.. 33

 

1-11-5: کاربرد های Real-time PCR: 34

 

1-12: بیان مساله. 34

 

1-13: ضرورت انجام تحقیق.. 35

 

1-14: اهداف پژوهش…. 36

 

فصل دوم: مروری بر متون گذشته

 

2-1: مطالعات انجام شده در ایران. 38

 

2-2: مطالعات انجام شده در خارج از ایران. 39

 

فصل سوم: مواد و روش ها

 

3-1: محیط های کشت… 43

 

3-1-1: محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-1-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 43

 

3-1-1-2: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 43

 

3-1-2: محیط کشت آگار خون دار. 44

 

3-1-2-1: روش تهیه 1000 میلی لیتر محیط کشت شکلات آگار. 44

 

3-1-3: محیط کشت BHI+ supplement مایع.. 44

 

3-1-3-1: مواد و دستگاه های مورد نیاز. 44

 

3-1-3-2: روش تهیه 500 میلی لیتر محیط کشت  BHI+ supplemenمایع.. 44

 

3-2: کشت نمونه ها 45

 

3-3: فریز کردن باکتری.. 45

 

3-3-1: مواد و تجهیزات لازم. 45

 

3-3-2: روش فریز کردن. 45

 

3-4: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا 46

 

3-4-1: تست نیاز های غذایی.. 46

 

3-4-2: رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-4-2-1: مواد و تجهیزات لازم. 46

 

3-4-2-2: روش رنگ آمیزی گرم. 46

 

3-5: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR). 47

 

3-5-1: استخراج DNA  از باکتری به روش جوشاندن. 47

 

 

3-5-1-1: مواد و تجهیزات لازم. 47

 

3-5-1-2: روش استخراج.. 48

 

3-5-2: پرایمرها 48

 

3-5-2-1: آماده سازی پرایمرها 49

 

3-5-3: برنامه PCR.. 49

 

3-5-4: تهیه مستر میکس PCR.. 50

 

3-5-4-1: مواد و تجهیزات لازم. 50

 

3-5-4-2: روش تهیه مسترمیکس…. 50

 

3-5-5: تهیه 500 میلی لیتر بافر TAE 10X.. 53

 

3-5-5-1: مواد و تجهیزات لازم. 53

 

3-5-5-2: روش تهیه بافر. 53

 

3-5-6: الکتروفورز محصول PCR.. 53

 

3-5-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 53

 

3-5-6-2: تهیه ژل آگارز جهت الکتروفوز. 53

 

3-5-6-3: روش الکتروفورز محصول PCR.. 54

 

3-6: استخراج PRP. 54

 

3-6-1: مواد و تجهیزات مورد نیاز. 54

 

3-6-2: تهیه  ml50 محلول CTAB 0.5 M… 54

 

3-6-3: تهیه ml 50  محلول NaCl 0.4 M… 55

 

3-6-4: روش استخراج PRP. 55

 

3-7: اندازه گیری PRP به روش بیال. 56

 

3-7-1: مواد و تجهیزات لازم. 56

 

3-7-2: روش اندازه گیری PRP. 56

 

3-8:تعیین تعداد کپی cap با استفاده از Real-time PCR: 57

 

3-8-1: مواد و تجهیزات لازم: 57

 

3-8-2: شرایط واکنش: 57

 

3-8-3: کمیت سنجی مطلق(Absolute quantification): 59

 

3-8-3-1: انجام و تخلیص محصول PCR برای منحنی استاندارد. 59

 

3-8-3-2: تهیه منحنی استاندارد. 60

 

3-8-4: کمیت سنجی نسبی (Relative Quantification): 62

 

3-9: تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از PCR : 62

 

فصل چهارم: نتایج

 

4-1: نتایج روش های تشخیص عمومی.. 65

 

4-1-1: نتایج نیاز غذایی.. 65

 

4-1-2: نتایج رنگ آمیزی گرم. 65

 

4-2: نتایج آزمون PCR.. 66

 

4-2-1: تایید هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار بودن نمونه ها 66

 

4-2-2: تایید تیپ b بودن نمونه ها 68

 

4-2-3: نتیجه نهایی PCR.. 69

 

4-2-4: مشاهده سوش جهش یافته Hib‾ در میان نمونه ها 72

 

4-3: نتایج سنجش PRP  به روش بیال. 72

 

4-4: نتایج Real-time PCR.. 73

 

4-4-1: کمیت سنجی نسبی: 74

 

4-4-2: کمیت سنجی مطلق: 77

 

4-5: نتایج تعیین ژنوتیپ: 82

 

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

 

5-1: بحث و نتیجه گیری.. 84

 

5-3: پیشنهادات… 87

 

منابع  …   89

 

خلاصه انگلیسی.. 98

 

فهرست جداول

 

جدول 1-1: نیاز گونه های مختلف هموفیلوس به فاکتورهای مختلف به فاکتورهای X و V   7

 

جدول 1-2: بیوتایپ های هموفیلوس آنفلونزا 8

 

جدول 3-1: لیست پرایمرها برای تایید Hib.. 48

 

جدول 3-2: برنامه PCR.. 50

 

جدول 3-3: مواد PCR.. 52

 

جدول3-4: پرایمرهای اولیگونوکلئوتیدی استفاده شده برای Real time PCR.. 58

 

جدول3-5: مواد واکنش برای Real-time PCR.. 61

 

جدول3-6 : برنامه واکنش Real-time PCR.. 61

 

جدول 3-7: پرایمر های مورد استفاده برای تعیین ژنوتیپ نمونه های منتخب… 63

 

جدول 3-8: برنامه دمایی واکنش PCR برای پرایمرهای K  و L.. 63

 

جدول 4-1: لیست نمونه ها و  نتایج PCR.. 70

 

جدول 4-2: میزان PRP نمونه های هموفیلوس آنفلونزا تیپ b.. 73

 

جدول 4-3 : نمونه های منتخب و میزان PRP. 74

 

جدول4-4: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و قطعه IS106 توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-5: کمیت سنجی نسبی ژن rpoB و ژن capb توسط Real-time PCR.. 75

 

جدول4-6: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه rpoB.. 78

 

جدول 4-7: نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه capB.. 78

 

جدول 4-8:  نتایج مربوط به منحنی استاندارد جایگاه IS1016. 78

 

جدول4-9: نتایج کمیت سنجی مطلق (تعداد کپی) جایگاه های rpoB, IS1016 و capB 79

 

جدول 4-10 : تعداد کپی جایگاه های capb و IS1016  نسبت به جایگاه تک کپی rpoB 80

 

فهرست تصاویر

 

شکل1-1: انتشار باسیل های گرم منفی، هموفیلوس و سایر باکتریهای نرمال و سخت رشد. 5

 

شکل 1-2: تست نوارهای X ، V و XV.. 7

 

شکل 1-3: ساختار پلی ساکارید های کپسولی هموفیلوس آنفلونزا (تیپ های a-f). 10

 

شکل 1-4: تظاهرات کلینیکی بیماریهای با عامل Hib بصورت درصد. 14

 

شکل 1-5: کشورهایی که از سال 1997 تا 2012 به برنامه واکسیناسیون علیه Hib پیوستن   18

 

شکل 1-6: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd.. 20

 

شکل 1-7: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f. 21

 

شکل 1-8: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده 24

 

شکل 1-9 : درخت تکاملی سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا 26

 

شکل1-10 : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap. 28

 

شکل 1-11: نحوه اتصال نشانگر سایبرگرین.. 30

 

شکل1-12: مکانیسم عمل SYBR Green به عنوان عامل متصل شونده به DNA.. 31

 

شکل1-13: رسم منحنی استاندارد. 33

 

شکل 3-1: ویال های آماده برای PCR روی یخ.. 52

 

شکل 4-1: رشد باکتری در حضور دیسک XV  و عدم رشد در حضور دیسک X و V.. 65

 

1-4-4-3-2- پروبیوتیک­ها و اثرات آنها……………………………………………………………………………………………………………….. 17

 

1-4-4-3-4- اثر مکمل­های پروبیوتیکی بر عملکرد طیور گوشتی…………………………………………………………………….. 18

 

1-4-4-3-5- پروبیوتیک ها و اثرات آنها بر فراسنجه های خونی………………………………………………………………………. 19

 

1-4-4-4- مصرف داروهای گیاهی به عنوان محرک رشد…………………………………………………………………………………… 20

 

1-4-4-6- چگونگی اثرگذاری ترکیبات فعال گیاهی …………………………………………………………………………………………. 22

 

1-4-4-7- اثرات داروهای گیاهی به عنوان محرک­رشد و چگونگی عمل آنها…………………………………………………… 27

 

1-4-4-8- پاسخ پرنده به محرک­های رشد گیاهی………………………………………………………………………………………………. 28

 

1-4-4-10- کلسترول سرم و اثرات ترکیبات گیاهی بر آن ……………………………………………………………………………… 28

 

1-4-4-11- محرک­های رشد گیاهی  و تاثیر آنها بر عملکرد طیور گوشتی……………………………………………………… 30

 

1-4-4-12- جمعیت میکروبی روده و تاثیر محرک­های رشد گیاهی بر آن……………………………………………………… 31

 

1-4-4- 13- خواص آنتی­­اکسیدانی محرک­های رشد گیاهی …………………………………………………………………………… 33

 

1-4-4-14- محرک­های رشد گیاهی و اثرات آنها بر هضم مواد مغذی…………………………………………………………….. 34

 

1–4-5-  محرک­های رشد گیاهی و اثر بر فراسنجه­های خونی…………………………………………………………………………… 35

 

1-4-5-1- عوامل مؤثر بر غلظت کلسترول پلاسما………………………………………………………………………………………………. 36

 

1-5- کبد………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 37

 

1-5-1- هپاتیت ناشی از داروها و سموم……………………………………………………………………………………………………………….. 40

 

1-5-1-1- هپاتیت ناشی از مسکن­ها……………………………………………………………………………………………………………………. 41

 

1-5-1-2- هپاتیت ناشی از آنتی بیوتیک­ها و ضد ویروس­ها………………………………………………………………………………. 42

 

1-5-1-3- هپاتیت ناشی از  گیاهان دارویی…………………………………………………………………………………………………………. 42

 

1-5-2- بررسی عملکرد کبد…………………………………………………………………………………………………………………………………… 43

 

1-5-2-1- آنزیم های کبدی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 43

 

1-5-2-1-1- آنزیم آلانین آمینو ترانسفراز(ALT) …………………………………………………………………………………………….. 44

 

1-5-2-1-2- آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)…………………………………………………………………………………………. 45

 

1-5-2-1-3- آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP)……………………………………………………………………………………………………….. 46

 

1-5-2-2-بیلی­روبینBilirubin……………………………………………………………………………………………………………………………… 46

 

1-5-2-3- پروتئین تام Total Protein………………………………………………………………………………………………………………… 47

 

1-5-2-4- آلبومین Albumin ……………………………………………………………………………………………………………………………… 48

 

1-6- معرفی گیاه یونجه…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 49

 

1-6-1- یونجه alfalfa…………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

 

1-7- اهداف تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 57

 

فصل دوم: مواد و روش ها……………………………………………………………………………………………………………………………………… 58

 

2-1-مواد و روش ‏ها………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 59

 

2-1-1-مواد و وسایل مورد نیاز برای عصاره گیری……………………………………………………………………………………………….. 59

 

2-1-2- عصاره گیری………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 60

 

2-2-محل و زمان اجرای طرح…………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

 

2– 3–موقعیت و ابعاد سالن……………………………………………………………………………………………………………………………………. 63

 

2–4–آماده­ سازی سالن…………………………………………………………………………………………………………………………………………… 65

 

2-5- برنامه بهداشتی و واکسیناسیون……………………………………………………………………………………………………………………. 66

 

2-6- اصول پرورش جوجه ها………………………………………………………………………………………………………………………………….. 67

 

2-7- صفات مورد بررسی در آزمایش2-7-1- میانگین افزایش وزن…………………………………………………………………. 68

 

2-7-1- میانگین افزایش وزن…………………………………………………………………………………………………………………………………. 68

 

2-7-2- فراسنجه ­های خونی………………………………………………………………………………………………………………………………….. 69

 

2-7-3- آزمایشگاه و پارامتر ‏های خونی…………………………………………………………………………………………………………………. 72

 

2-8-  مدل آماری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 73

 

2-8-1- روش تحقیق………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 73

 

2-8-2-  آنالیز آماری داده­ها…………………………………………………………………………………………………………………………………… 74

 

فصل سوم: نتایج……………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 75

 

3-1- روش تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 76

 

3-1-1- مقایسه گروه­ها از حیث آنزیم­های کبدی…………………………………………………………………………………………………. 77

 

3-1-1-1-آنزیم کبدی AST………………………………………………………………………………………………………………………………….. 80

 

3-1-1-2- آنزیم کبدی ALT………………………………………………………………………………………………………………………………… 81

 

3-1-1-3- آنزیم کبدی ALP………………………………………………………………………………………………………………………………… 83

 

3-1-2- مقایسه گروهها از حیث سایر فاکتورها……………………………………………………………………………………………………… 85

 

 

3-1-2-1- مقایسه گروه­ها از نظر میزان پروتئین………………………………………………………………………………………………….. 90

 

3-1-2-2- مقایسه گروه­ها از نظر میزان آلبومین………………………………………………………………………………………………….. 91

 

3-1-2-3- مقایسه گروه­ها از نظر میزان بیلی­روبین………………………………………………………………………………………………. 92

 

3-1-2-4- مقایسه گروه­ها از نظر میزان تری­گلیسیرید………………………………………………………………………………………… 93

 

3-1-2-5- مقایسه گروه­ها از نظر میزان کلسترول………………………………………………………………………………………………… 94

 

3-1-2-6- مقایسه گروه­ها از نظر میزان وزن…………………………………………………………………………………………………………. 95

 

فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری…………………………………………………………………………………………………………………………. 96

 

4-1- بررسی فایتوژنیک­های شناخته شده…………………………………………………………………………………………………………….. 97

 

4-2- استفاده از فایتوژنیک ها در جیره­ی غذایی طیور………………………………………………………………………………………… 98

 

4-3- سایر تحقیقات در زمینه­ استفاده از گیاهان دارویی در طیور…………………………………………………………………… 98

 

4-4- بحث و نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………….. 100

 

4-5- نتیجه گیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 105

 

پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 108

 

فهرست منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 109

 

 

 

فهرست نمودارها

 

3-1- نمودار ستونی میزان AST در گروه های مورد مطالعه………………………………………………………………………………… 81

 

3-2- نمودار ستونی میزان ALT در گروه های مورد مطالعه……………………………………………………………………………….. 82

 

3-3- نمودار ستونی میزان ALT در گروه های مورد مطالعه………………………………………………………………………………… 84

 

3-4- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان پروتئین………………………………………………………………. 90

 

3-5- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان آلبومین………………………………………………………………. 91

 

3-6- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان بیلی­روبین…………………………………………………………… 92

 

3-7- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان تری­گلیسیرید……………………………………………………… 93

 

3-8- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث میزان کلسترول…………………………………………………………….. 94

 

3-9- مقایسه میانگین گروه های مورد مطالعه از حیث وزن………………………………………………………………………………… 95

 

فهرست جداول

 

1-1: تاکسونومی گیاه یونجه…………………………………………………………………………………………………………………………………….. 50

 

2- 1- گروه بندی تیمارها و غلظت مصرفی عصاره­ها…………………………………………………………………………………………….. 65

 

2- 2- برنامه واکسیناسیون جوجه­های گوشتی……………………………………………………………………………………………………… 66

 

2-3- روش آزمایش و کیت­های مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………….. 72

 

3-1: مقدار میانگین و انحراف استاندارد گروه­های مورد مطالعه در سه متغیر وابسته(آنزیم های کبدی)…………. 78

 

3-2- تاثیرعصاره یونجه بر کاهش مسمومیت ………………………………………………………………………………………………………… 79

 

3-3- آزمون مقایسه­های زوجی دانت بین گروه­های آزمایشی و شاهدمسموم از نظر آنزیم کبدی AST………….. 80

 

3-4- آزمون مقایسه­ای زوجی دانت، بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر آنزیم کبدی ALT…………. 82

 

3-5- آزمون مقایسه­های زوجی بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر آنزیم کبدی ALP………………….. 83

 

3- 6- مقدار میانگین و انحراف استاندارد گروه­های مورد مطالعه در شش متغیر وابسته…………………………………… 85

 

3-7- جدول تحلیل واریانس تاثیر کاربندی­های مختلف بر 6 متغیر وابسته………………………………………………………… 87

 

3-8- آزمون مقایسه­های زوجی بین گروه­های آزمایشی و شاهد مسموم از نظر 6 متغیر وابسته………………………. 88

 

چکیده:

 

مقدمه: اکثر بیماری­های رایج در صنعت مرغداری کشورکه بطور همه­گیر جوجه­های گوشتی را مبتلا می­کنند، عملکرد کبد را مختل می­نمایند. کبد به عنوان اندام تشخیصی بسیار مهمی در جوجه­های گوشتی مطرح است. از طرفی به دلیل تشدید متابولیسم در جوجه­های گوشتی به منظور افزایش تولید و راندمان، کبد به عنوان مرکز مهم درگیر در متابولیسم و واسطه­ی مهم دستگاه گوارش و خون از اهمیت خاصی برخوردار است، بطوری­که هر گونه آسیب کبدی در جوجه­های گوشتی در نخستین گام روی تغذیه و نهایتاٌ راندمان تولید جوجه­ها تاثیر خواهد داشت.

 

روش بررسی: تعداد 120 قطعه جوجه یک‏روزه به‏طور تصادفی به دو گروه مسموم و غیر مسموم با سه تیمار برای هر گروه و 20 تکرار برای هر تیمار تقسیم شدند. تیمارها شامل: کنترل شاهد، یونجه1رقیق، یونجه2غلیظ؛ شاهد مسموم، یونجه1رقیق مسموم، یونجه2غلیظ مسموم می­باشد؛ که در پایان دوره پرورش، آنزیم‏های شاخص عملکرد کبد(AST,ALT,ALP) به همراه فاکتورهای خونی: پروتئین تام، آلبومین و بیلیروبین، کلسترول و تری­گلیسیرید سرم تعیین شدکه نتایج به شرح زیر می­باشد: از لحاظ آماری یونجه 1/0 ٪ برای آنزیم کبدی AST در سطح P<0/05 و آنزیم کبدی ALP در سطح01/0P< بطور معنی­دار کاهش نشان داد. آنزیم ALT کاهش معنی­داری نداشت. فاکتور بیلی­روبین در دوز 15/0 ٪ بطور معنی­داری در سطح P<0/05 افزایش نشان داد. فاکتور پروتئین تام نیز کاهش معنی­داری در سطح01/0P< داشت. فاکتور آلبومین تغییر معنی­داری نسبت به شاهد مسموم نشان نداد. فاکتور تری­گلیسیرید بطور معنی­داری درسطح01/0P< کاهش یافت. کلسترول به همراه متغیر وزن، افزایش معنی­داری در سطح01/0P< داشتند.

 

1-8-4-اسپرم‌های غیر طبیعی.. 18

 

1-8-6-ماهیت دودمانی سلول‌های زایا 18

 

1-8-7-سلول‌های سرتولی.. 19

 

1-8-8-بافت بینابینی بیضه. 19

 

1-9-تستوسترون. 20

 

1-9-1- اعمال تستوسترون. 20

 

1-10-تولید جنین در شرایط In vivo. 20

 

1-10-1-لقاح.. 20

 

1-10-2-نزدیک شدن گامت‌ها 20

 

1-10-3- آمیختن گامت‌ها 21

 

1-10-4- نتایج لقاح.. 21

 

1-10-5-تسهیم. 22

 

1-10-6-ظرفیت پذیری اسپرم. 23

 

1-10-7- لقاح آزمایشگاهی (IVF) 23

 

1-11-کلیاتی در رابطه با رت(موش صحرایی) 25

 

1-11-1-بلوغ. 25

 

1-12-تاریخچه درمانی گیاهان. 26

 

1-13-ویژگی های آنتی اکسیدانتی گیاهان. 26

 

1-14-استفاده ازگیاهان در درمان بیماری دیابت… 26

 

1-15-آلوئه ورا 27

 

1-15-1:تاریخچه ی آلوئه ورا 27

 

1-15-2-مشخصات ظاهری گیاه 28

 

1-15-2-1-ترکیبات شگفت آور این گیاه چیست… 29

 

1-15-2-2-دلایل عمده برای انتخاب وخواص مصرف ژل آلوئه ورا 30

 

فصل دوم :مواد وروش کار

 

2-1- گروه بندی حیوانات… 33

 

2-2 روش ایجاد دیابت تجربی.. 34

 

2-3 نحوه اندازه گیری قند خون. 34

 

2-4- نحوه تهیه ژل گیاهی.. 35

 

2-5- نحوه تجویز عصاره به حیوان. 35

 

2-6-نمونه برداری: 35

 

2-7-بررسی قابلیت باروری آزمایشگاهی(IVF) 36

 

3-7-1-آماده سازی اسپرم ها برای باروری آزمایشگاهی.. 36

 

2-7-2-آماده سازی محیط کشت برای IVF.. 36

 

3-7-3- طرز تهیه محیط کشت جنین (mR1ECM) 36

 

2-7-4-تخمک گیری از رتهای  ماده 37

 

2-7-5- عمل لقاح.. 37

 

2-7-6-ارزیابی رشد جنین ها 37

 

2-8-نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم. 38

 

2-9-  شمارش اسپرم ها 38

 

2-10 بررسی قدرت زیست پذیری اسپرم. 38

 

2-11- ارزیابی کیفیت کروماتین/DNA اسپرم توسط رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB) 39

 

2-12- بررسی میزان آسیب DNA اسپرم. 39

 

2-13 آزمایشات بیوشیمیایی سرم. 39

 

2-14-آزمایش  بیوشیمیایی بافت بیضه. 40

 

2-14-1-اندازه گیری میزان مالون دی-آلدئید (MDA) بافت بیضه. 40

 

2-14-2-سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز: 40

 

2-14-3-اندازه گیری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی تام(TAOC) در بافت بیضه. 40

 

2-15-بررسی بافت بیضه. 41

 

2-16 رنگ آمیزی.. 42

 

2-16-1 رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین.. 42

 

2-16-2 مراحل مختلف رنگ آمیزی.. 43

 

3-16-3رنگ آمیزی در هماتوکسیلین.. 43

 

 

2-16-4رنگ آمیزی وان گیسن (Van Geison) 44

 

2-17- ارزیابی هیستومورفومتری بیضه. 46

 

2-18-ارزیابی میزان اسپرماتوژنز در بافت بیضه. 47

 

2-18-1-شاخص ضریب تمایز لوله ای (TDI) 47

 

2-18-2-ضریب بازسازی(RI) 47

 

2-18-3-ضریب میوزی (MI) 47

 

2-18-4-شاخص میزان اسپرمیوژنز (SPI) 47

 

2-19-روش بررسی آماری.. 47

 

فصل سوم :نتایج

 

3-1-علائم بالینی.. 49

 

3-2- بررسی تغییرات قندخون. 49

 

3-3-نتایج مربوط به تغییرات وزنی.. 51

 

3-3-1 : نتایج مربوط به تغییرات وزن بدن. 51

 

3-3-2 : نتایج مربوط به تغییرات وزن بیضه. 51

 

3-3-3-یافته های مورفولوژیک بافت بیضه. 52

 

3-3-4-یافته های هیستومورفومتریک در بافت بیضه. 56

 

3-3-4-1- تغییرات لوله های منی ساز. 56

 

3-3-4-2- نتایج حاصل از مطالعه تعداد سلولهای لنفاوی در بافت بیضه(MNLCN) 57

 

3-3-4-3-نتایج حاصل از مطالعه تعداد سلولهای لیدیگ (LCN) 58

 

3-3-5-نتایج حاصل از ارزیابی اسپرماتوژنز در بافت بیضه. 59

 

3-3-5-1-نتایج حاصل از مطالعه ضریب میوزی(MI) 59

 

3-3-5-2-نتایج حاصل از مطالعه ضریب تمایز لوله ای (Tubular differentiation Index) 60

 

3-3-5-3-نتایج حاصل از مطالعه ضریب بازسازی (Repopulation Index) لوله های منی ساز. 60

 

3-3-5-4-نتایج حاصل از مطالعه ضریب اسپرمیوژنز (SPI) 61

 

3-3-5-5-نتایج حاصل ازضریب سلول سرتولی(Sertoli cell index ) 61

 

3-5-بررسی سطح سرمی تستوسترون. 62

 

3-6- مطالعه تغییرات مربوط به پارامترهای اسپرم. 62

 

3-6-1- نتایج حاصل از مطالعه درصد تعداد اسپرم های زنده در دم اپیدیدیم. 62

 

3-6-2-تحرک اسپرم. 64

 

3-6-2-1نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای دارای تحرک پیشرونده((RPFM… 64

 

3-6-2-2-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای داری حرکت پیشرونده کند(SPFM) 64

 

3-6-2-3-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای داری تحرک درجا(RI) 65

 

3-6-2-4-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای فاقد تحرک(ML) 66

 

3-7-نتایج حاصل از مطالعه درصد اسپرمهای با کروماتین آسیب دیده 66

 

3-8-نتایج حاصل از مطالعه درصد تعداد اسپرمهای نابالغ. 68

 

3-9نتایج حاصل از مطالعه تعداد اسپرم. 69

 

3-6-نتایج ارزیابی های بیوشیمیایی بافت بیضه. 67

 

3-7- بررسی توان باروری.. 69

 

4-7-1-نتایج حاصل از تعداد اووسیتهای لقاح یافته. 71

 

3-7-2-نتایج حاصل از مطالعه درصد جنین های دو سلولی.. 70

 

3-7-3-نتایج حاصل از مطالعه درصد جنین های چهار سلولی.. 71

 

3-7-4-نتایج حاصل از مطالعه درصد بلاستوسیتها 72

 

فصل چهارم:بحث

 

4-1-بحث… 75

 

4-2-تغییرات وزنی وارتباط آن با دیابت… 78

 

4-3-میزان گلوکزخون وارتباط آن با دیابت… 76